猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法及应用技术

本发明专利技术提供了猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法及应用，属于生物基因工程领域。该方法包括的步骤有：

Feline interferon \u03b3 Soluble prokaryotic expression and purification method and its application

【技术实现步骤摘要】
猫干扰素
γ
的可溶性原核表达和纯化方法及应用


[0001]本专利技术属于生物基因工程领域，特别涉及猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法及应用。

技术介绍

[0002]干扰素(interferon，IFN)是一种由机体免疫细胞产生，在诱生剂作用于活细胞后，细胞分泌的一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性的糖蛋白。根据干扰素的来源、生物学性质及活性，将干扰素分Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型干扰素主要起抗病毒和抗肿瘤作用，包括IFN
‑
α、IFN
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β、IFN
‑
ω、IFN
‑
ε、IFN
‑
κ、IFN
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τ、IFN
‑
δ和IFN
‑
ζ，Ⅱ型干扰素中仅有IFN
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γ亚型，在抗胞内病原体的宿主防御中起关键作用。1992年，日本东丽株式会社的Nakamura等人首次分离到了猫干扰素基因，将其归类为ω型干扰素，有研究表明IFN
‑
ω对于猫白血病毒(FLV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)共感染的猫以及细小病毒具有明显治疗效果，之后在此基础上证明了IFN
‑
ω对FIV的复制有抑制作用且存在剂量依赖性。由于猫IFN的抗病毒能力相当广泛且具有显著效果，因此研究猫IFN的抗病毒机制和治疗有关猫病毒病的实践中具有重要意义。IFN
‑
γ作为一种新型干扰素，在抗病毒和抗肿瘤方面发挥较强的作用，1995年鸡IFN
‑<br/>γ基因被首次成功克隆，随后成功表达出重组鹅、家兔、猪、牛等动物的IFN
‑
γ并将其用于临床治疗，但有关猫的IFN
‑
γ研究却鲜少被报道。
[0003]近年来，人们生活水平迅速提高，带动了养宠业蓬勃发展，与猫有关的疾病特别是病毒性疾病逐年增多。干扰素作为机体重要的防疫系统成员能够对抗病毒感染，而体外表达的干扰素与天然干扰素具有高度相似的生物学活性。所以，体外表达的猫干扰素有望增强宠物猫的免疫力，降低患病率和死亡率。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法及应用，该方法制备得到的猫干扰素γ具有良好的生物活性，能够用于治疗猫病毒感染性疾病。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0006]一种猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法，包括以下步骤：
[0007](1)FeIFN
‑
γ蛋白的信号肽序列和理化性质分析
[0008]通过SignalP
‑
4.0Server和Expasy在线服务器分别预测、分析两种蛋白的信号肽段和理化性质；
[0009](2)原核表达质粒pET28a
‑
SUMO
‑
FeIFN
‑
γ的构建
[0010]根据GenBank收录的FeIFN
‑
γ的序列，舍弃掉信号肽后设计PCR引物，上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示，并分别通过引物引入BamH I和HindⅢ酶切位点，进行PCR扩增，然后将PCR产物经双酶切后回收目的基因片段，同时双酶切、回收pET28a
‑
SUMO载体片段，经T4DNA连接酶连接后，转入DH
‑
5α感受态细胞，提取质粒经PCR和双酶切验证后测序，测序正确后命名为pET28a
‑
SUMO
‑
FeIFN
‑
γ；
[0011](3)含重组质粒的BL21细菌的诱导表达与重组蛋白的可溶性分析
[0012]将重组质粒pET28a
‑
SUMO
‑
FeIFN
‑
γ转入BL21感受态细胞，挑取单克隆菌落，接种于含有卡那霉素抗性的LB培养液中过夜培养，次日以1:100转接入新的含卡那霉素抗性的LB培养液中，于37℃、220r/min摇床震荡培养2h，待菌液OD
600
值达到0.6～0.8，取1mL菌液作为对照，剩余菌液加入IPTG诱导剂，终浓度为1mmol/L，在16℃、220r/min摇床培养10h后以8000rpm离心10min收集菌体，弃去上清后的菌体沉淀加入结合缓冲液，用移液器多次吹打使菌体重悬并加入PMSF，终浓度为1mmol/L，重悬后的菌液超声破碎，全程置于冰上操作，超声3s，停顿4s，功率220W，以菌液变得清澈透亮为准，超声结束后将菌液以10000rpm离心10min，收集上清、沉淀制备样品，用SDS
‑
PAGE电泳检测分析蛋白的表达水平及水溶性情况；
[0013](4)SUMO
‑
FeIFN
‑
γ融合蛋白最佳表达条件的筛选
[0014]在培养瓶中以1：100加入菌液和含卡那霉素抗性的LB培养液，于37℃、220r/min摇床震荡培养，当菌液OD
600
值到0.6～0.8时，将各培养瓶分别按IP TG浓度梯度、诱导温度梯度及时间梯度进行条件筛选，用SDS
‑
PAGE电泳检测；所述IPTG浓度梯度为0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mm ol/L，诱导温度梯度为37℃、30℃、22℃、16℃，时间梯度3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h；
[0015](5)SUMO
‑
FeIFN
‑
γ融合蛋白的大量表达和纯化
[0016]在确定最佳表达条件后扩大培养，将诱导、超声后的上清用0.45μm孔径的滤膜过滤后进行纯化，取Ni亲和层析柱用蒸馏水清洗，并用结合缓冲液平衡多次，然后将滤液加入层析柱后置于室温结合2h，以0.5～1mL/min的流速收集流穿液；将层析柱的液体用洗涤缓冲液以1mL/min的流速清洗Ni柱，以8～10倍柱体积的用量去除杂蛋白；最后用5～10倍柱体积的洗脱缓冲液以0.5～1mL/min的流速洗脱层析柱上的蛋白，收集的样品均要置于冰上，最后用SDS
‑
PAGE电泳检测；
[0017](6)SUMO
‑
FeIFN
‑
γ融合蛋白的酶切和纯化
[0018]将Sumo蛋白酶以1：10比例加入融合蛋白液，4℃条件下酶切，分别收集3h、6h、9h、12h不同时间点的酶切产物，使用30ku截留柱和10ku截留柱对酶切后的蛋白脱盐、浓缩和进一步纯化，SDS
‑
PAGE电泳检测，用Bradford测定法测定目的蛋白浓度。
[0019]进一步的，所述结合缓冲液为含50mM Na2HPO4、300mM NaCl、10mM咪唑的pH8.0的溶液。
[0020]进一步的，所述SUMO
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)FeIFN
‑
γ蛋白的信号肽序列和理化性质分析通过SignalP
‑
4.0Server和Expasy在线服务器分别预测、分析两种蛋白的信号肽段和理化性质；(2)原核表达质粒pET28a
‑
SUMO
‑
FeIFN
‑
γ的构建根据GenBank收录的FeIFN
‑
γ的序列，舍弃掉信号肽后设计PCR引物，上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示，并分别通过引物引入BamH I和HindⅢ酶切位点，进行PCR扩增，然后将PCR产物经双酶切后回收目的基因片段，同时双酶切、回收pET28a
‑
SUMO载体片段，经T4DNA连接酶连接后，转入DH
‑
5α感受态细胞，提取质粒经PCR和双酶切验证后测序，测序正确后命名为pET28a
‑
SUMO
‑
FeIFN
‑
γ；(3)含重组质粒的BL21细菌的诱导表达与重组蛋白的可溶性分析将重组质粒pET28a
‑
SUMO
‑
FeIFN
‑
γ转入BL21感受态细胞，挑取单克隆菌落，接种于含有卡那霉素抗性的LB培养液中过夜培养，次日以1:100转接入新的含卡那霉素抗性的LB培养液中，于37℃、220r/min摇床震荡培养2h，待菌液OD
600
值达到0.6～0.8，取1mL菌液作为对照，剩余菌液加入IPTG诱导剂，终浓度为1mmol/L，在16℃、220r/min摇床培养10h后以8000rpm离心10min收集菌体，弃去上清后的菌体沉淀加入结合缓冲液，用移液器多次吹打菌体重悬并加入PMSF，终浓度为1mmol/L，重悬后的菌液超声破碎，全程置于冰上操作，超声3s，停顿4s，功率220W，以菌液变得清澈透亮为准，超声结束后将菌液以10000rpm离心10min，收集上清、沉淀制备样品，用SDS
‑
PAGE电泳检测分析蛋白的表达水平及水溶性情况；(4)SUMO
‑
FeIFN
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γ融合蛋白最佳表达条件的筛选在培养瓶中以1：100加入菌液和含卡那霉素抗性的LB培养液，于37℃、220r/min摇床震荡培养，当菌液OD
600
值到0.6～0.8时，将各培养瓶分别按IPTG浓度梯度、诱导温度梯度及时间梯度进行条件筛选，用SDS

【专利技术属性】
技术研发人员：魏衍全，张勇，成述儒，武小椿，任丽君，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：