一种基于分子动力学模拟的核酸适配体优化设计方法技术

本发明专利技术属于核酸适配体设计技术领域，具体为一种基于分子动力学模拟的核酸适配体优化设计方法。本发明专利技术从SELEX技术筛选所得核酸适配体的3D结构出发，通过自发结合模拟获得小分子结合核酸适配体所形成复合物的3D结构；并分析复合物的结构和关键结合位点，利用所得信息指导核酸适配体序列的截短优化。本发明专利技术已用于特异结合毒素TTX的核酸适配体TTX

An optimization design method of aptamers based on molecular dynamics simulation

【技术实现步骤摘要】
一种基于分子动力学模拟的核酸适配体优化设计方法


[0001]本专利技术属于核酸适配体设计
，具体涉及核酸适配体设计方法。

技术介绍

[0002]核酸适配体是一段单链脱氧核糖核酸(ssDNA)，核糖核酸(RNA)，可通过折叠形成不同且复杂的二级或三级结构以较高亲和力与特异靶标结合(1,2)。由于核酸适配体对靶标具有高特异性和高亲和性，因此其也被称为化学抗体，解离平衡常数(K
d
)通常在皮摩尔至纳摩尔范围内。与抗体相比，得益于体外筛选的核酸适配体，合成简单，运输简便，易于化学修饰，拥有更为广阔的靶标分子，包括金属离子、小分子、蛋白质、细胞和病毒等，故在医学诊断和治疗、生物传感及检测、药物递送等领域有重大潜力(3)。
[0003]核酸适配体主要由SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment, 指数富集配基进化)技术筛选得到，其基本原理(4)：在筛选之前，要合成一个包含多达10
15
个不同序列的单链寡核苷酸文库，每一轮筛选分离出未结合序列，富集有亲和力的核酸序列，通过多轮筛选后，得到具有高亲和性和高特异性的寡核苷酸链即为该靶标分子的适配体。然而，传统的SELEX技术需要经过数周乃至数月的时间才能获得特定的候选适配体，命中率很低；除此之外，很多情况下，筛选得到的核酸适配体长度通常太长，导致合成成本较高，也存在冗余碱基序列，在检测过程中易出现副反应，不利于工程化使用。
[0004]因此，急需提出一种post
‑
SELEX (后SELEX)优化设计方法，以在保证结合活性的前提下，截短核酸适配体序列。但是目前多数结构剪裁方法大多采用试错法随机尝试，尚无基于结构指导的理性设计方法。理论上，小分子结合核酸适配体所形成复合物的3D结构能够通过X射线结晶衍射(X
‑
ray Crystallography)(5)和核磁共振(NMR, Nuclear Magnetic Resonance)(6)实验方法获得。但是，核酸适配体具有较强的灵活性，这些方法难以大量应用，故采用计算方法建立结构模型以优化核酸适配体。

技术实现思路

[0005]本专利技术的一个目的是提供一种采用分子动力学模拟，并基于复合物的结构进行截短设计的核酸适配体优化方法，记为post
‑
SELEX优化方法。
[0006]本专利技术的另一目的是提供靶向TTX的核酸适配体TTX
‑
27的截短型高亲和力变异体(TTX
‑
D2)。
[0007]本专利技术提出的基于分子动力学模拟的核酸适配体优化设计方法，采用自发结合模拟获得靶标小分子结合核酸适配体所形成复合物的稳定结构，规避了核酸适配体因灵活性较强而难以通过实验方法获得其3D结构这一问题。随后通过分析复合物的结构，理性地设计亲和力不弱于原适配体并且序列更短的变体适配体，并采用分子对接的方法评估优化方案。为SELEX筛选所得的核酸适配体提供一种合理且有效的post
‑
SELEX优化方法。本专利技术提供的基于单核苷酸分子对接的核酸适配体设计方法，具体步骤为：第一步：进行分子对接，预测靶标分子与核酸适配体结合时的解离平衡常数。
[0008]其中，分子对接所用软件为AutoDock分子对接软件包(7)，配体分子为靶标小分子，受体分子为靶标分子核酸适配体；分子对接采用的算法为拉马克遗传算法(LGA)，该算法将遗传算法和局部搜索结合在一起，遗传算法用于全局搜索，局部搜索用于能量优化；对接方法采用的是半柔性对接，即在对接过程中，核酸适配体的构象不发生变化，而靶标分子的构象在一定的范围内变化；为了确保靶标分子能够充分搜索构象，将对接格子的长宽高均设置为150
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；格点之间的间隔为0.375
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，对接格子的中心为核酸适配体的几何中心；第二步：进行配体自发结合分子动力学模拟，以获得稳定的靶标小分子结合核酸适配体所形成复合物的3D结构；其中，靶标小分子的通用AMBER力场参数采用AmberTools自带的Antechamber软件包生成；同时采用GROMACS
‑
5.1.4分子动力学软件包(8)，AMBER99bsc1力场及SPC水模型(9,10)对模拟体系进行建模；在模拟系统中，核酸适配体置于水盒子的中心，且距水盒子表面的最小距离为15
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；为了与溶液环境保持一致，将插入金属阳离子和相应的阴离子使溶液环境保持中性；模拟过程采用周期性边界条件，静电和范德华相互作用分别采用PME(9)和Cut
‑
off方法计算，截断距离均为14
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；所有化学键均受LINCS算法(11)约束；其中，积分时间步长为1~3 fs；具体过程为：首先利用最陡下降算法对模拟系统进行能量最小化；然后采用v
‑
rescale恒温器控制系统平衡温度，berendsen压力耦合平衡压强(12)；最后，在md集成器(13)中对体系进行时间长度不少于150 ns分子动力学模拟；第三步：分析复合物的结构并截短核酸适配体；在第二步中获得了靶标分子与核酸适配体的分子动力学模拟轨迹，根据轨迹中稳定结合状态下的复合物结构，分析结合模式，将远离结合部位的茎环序列截去并利用Mini
‑
hairpin序列(14)替代，获得截短优化适配体；Mini
‑
hairpin的茎状结构含有3~4对互补的碱基对，环状结构含有3~4个孤立的碱基；Mini
‑
hairpin的3D结构通过Rosetta程序中的RNA 3D structure modeling模块(15)获得；第四步：利用分子对接评估优化方案；通过分子对接，预测靶标小分子与截短型核酸适配体结合时的解离平衡常数，并与第一步中预测的靶标分子与原核酸适配体结合时的解离平衡常数作比较，如果截短型核酸适配体解离平衡常数小于原核酸适配体解离平衡常数，则表明优化设计初步成功。
[0009]其中，分子对接所用软件为AutoDock分子对接软件包，配体分子为靶标小分子，受体分子为截短型核酸适配体；分子对接采用的算法为拉马克遗传算法(LGA)，；对接方法采用的是半柔性对接；将对接格子的长宽高均设置为150
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；格点之间的间隔为0.375
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，对接格子的中心为截短型核酸适配体的几何中心；第五步：采用微量热泳动（MST）实验检测核酸适配体与靶标小分子的结合强度；微量热泳动(MST, microscale thermophoresis)(16)利用分子的热泳动现象，通过测量温度梯度下，分子耦合时水化层、分子大小和电荷等微小变化引发的热泳动变化，进而分析分子之间的相互作用；对于每一组MST实验，设计16个靶标小分子的浓度用于16根毛细管，利用梯度稀释法1:1稀释靶标小分子，其中每根毛细管中核酸适配体的浓度固定；荧光标记于核酸适配体3...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于分子动力学模拟的核酸适配体优化设计方法，其特征在于，具体步骤为：第一步：进行分子对接，预测靶标分子与核酸适配体结合时的解离平衡常数；其中，分子对接所用软件为AutoDock分子对接软件包，配体分子为靶标小分子，受体分子为靶标分子核酸适配体；分子对接采用的算法为拉马克遗传算法(LGA)，该算法将遗传算法和局部搜索结合在一起，遗传算法用于全局搜索，局部搜索用于能量优化；对接方法采用半柔性对接，即在对接过程中，核酸适配体的构象不发生变化，而靶标分子的构象在一定的范围内变化；为了确保靶标分子能够充分搜索构象，将对接格子的长宽高均设置为150
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；格点之间的间隔为0.375
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，对接格子的中心为核酸适配体的几何中心；第二步：进行配体自发结合分子动力学模拟，以获得稳定的靶标小分子结合核酸适配体所形成复合物的3D结构；其中，靶标小分子的AMBER力场参数采用AmberTools自带的Antechamber软件包生成；同时采用GROMACS
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5.1.4分子动力学软件，AMBER99bsc1力场及SPC水模型对模拟体系进行建模；在模拟体系中，核酸适配体置于水盒子的中心，且距水盒子表面的最小距离为15
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；为了与溶液环境保持一致，将插入金属阳离子和相应的阴离子使溶液环境保持中性；模拟过程采用周期性边界条件，静电和范德华相互作用分别采用PME和Cut
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off方法计算，截断距离均为14
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；所有化学键均受LINCS算法约束；其中，积分时间步长为1~3 fs；具体过程为：首先利用最陡下降算法对模拟系统进行能量最小化；然后采用v
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rescale恒温器控制系统平衡温度，berendsen压力耦合平衡压强；最后，在md集成器中对体系进行时间长度不少于150 ns分子动力学模拟；第三步：分析复合物的结构并截短核酸适配体；在第二步中获得了靶标分子与核酸适配体的分子动力学模拟轨迹，根据轨迹中稳定结合状态下的复合物结构，分析结合模式，将远离结合部位的茎环序列截去，并利用mini
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【专利技术属性】
技术研发人员：黄强，颜志超，刘建平，李园园，宋梦华，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：