一种利用酚-氯仿法快速提取黄河鲤基因组DNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用酚‑氯仿法快速提取黄河鲤基因组DNA的方法，其具体过程为：采用涡旋震荡10s的混合方式将样品与混合试剂混合均匀，其中混合试剂为体积比25:24:1的苯酚、氯仿与异戊醇的混合溶液，再利用低温冷冻离心机在12000rpm、4℃的条件下离心2min，最终提取得到黄河鲤基因组DNA。本发明专利技术改进了传统酚‑氯仿提取方法，大大缩短了实验用时，提高了实验效率。

【技术实现步骤摘要】
一种利用酚-氯仿法快速提取黄河鲤基因组DNA的方法
本专利技术属于黄河鲤基因组DNA提取方法
，具体涉及一种利用酚-氯仿法快速提取黄河鲤基因组DNA的方法。
技术介绍
黄河鲤（Cyprinuscarpiohaematopterus）是我国淡水鱼类中种类最多、分布最广泛的品种之一，在中国中北部具有很高的市场价值和发展前景。但在现实中由于环境污染，水域生态平衡及生物资源受到很大破坏，张超峰等研究了郑州黄河鲤的种质资源现状并提出保护对策，而这些研究都需要借助对DNA的研究，DNA序列为物种的演化和分类提供了极为重要的遗传信息，因此得到高质量的DNA更有利于PCR扩增和获取目的基因等后续各项实验研究。血液是提取基因组DNA常用的材料，但抽血过多会对实验用鱼的存活及生长造成很大影响，且操作较为复杂，该方法不太适用于大量制备样品。梁利群等认为由于鱼类鳍条中上皮细胞、骨细胞等组织的存在，所含基因组DNA足够保证检测外源基因的需要。剪取鱼类鳍条与抽血、取肝脏或肌肉组织的方法相比操作更为简便，同时可以避免损伤和杀害样本。酚-氯仿法是提取基因组DNA最经典的方法之一，该方法成本较低，提取效率相对较高，但操作步骤复杂，所用试剂较多且用时较长。刘臻等运用试剂盒法和酚-氯仿法提取鲫鱼基因组DNA，并对两种方法的实验结果进行了对比。马洪雨等用改进后的酚-氯仿法所提取的三种鱼类肌肉组织基因组DNA的质量显著高于传统酚-氯仿法。范慧慧等通过改进后的酚-氯仿法同样能够获得高质量的香鱼肌肉组织基因组DNA。综上，改进酚-氯仿法的部分步骤从而提高鱼类基因组DNA质量的研究已有很多，但专门针对缩短主要提取步骤的时间来提高实验效率的研究报道在鱼类基因组DNA领域还未看到，而在临床医学领域较为常见。在常规凝血实验中，LippiGiuseppe等人为减少制备血液标本的样品处理时间，设计实验建立了一个最小合适的离心时间。根据他们的实验，在1500xg5-10min离心时间最适合于收集常规凝血试验的初级管。DenisMonneret等人和RichardPrusa为提高医院实验室周转效率，分别就离心时间、收集时间等作了研究比较。崔明等探讨了缩短离心时间对临床常用心肌损伤标志物检测结果的影响，结果表明缩短离心时间不影响检测结果，同时可以缩短标本周转时间。本实验拟对传统酚-氯仿法部分步骤进行改进，以期在不影响实验效果的前提下尽量提高实验效率。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是提供了一种利用酚-氯仿法快速提取黄河鲤基因组DNA的方法，该方法优化了利用酚-氯仿法提取鲤基因组DNA的时间条件，提高了实验效率，为鲤DNA分子生物学研究提供了基础和前提。本专利技术为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种利用酚-氯仿法快速提取黄河鲤基因组DNA的方法，其特征在于具体过程为：采用涡旋震荡10s的混合方式将样品与混合试剂混合均匀，其中混合试剂为体积比25:24:1的苯酚、氯仿与异戊醇的混合溶液，再利用低温冷冻离心机在12000rpm、4℃的条件下离心2min，最终提取得到黄河鲤基因组DNA。本专利技术所述的利用酚-氯仿法快速提取黄河鲤基因组DNA的方法，其特征在于具体步骤为：步骤S1：用灭菌后的剪刀剪取黄河鲤新鲜鳍条组织，剪碎后置于灭菌的EP管内备用；步骤S2：在EP管内加入组织提取液和蛋白酶K，其中组织提取液的成分为：Tris-Cl10mmol/L、EDTA100mmol/L、NaCl100mmol/L和SDS0.5wt%，盖上瓶盖后颠倒混匀，再放入干式恒温器中设置温度为55℃消化过夜，直至消化澄清；步骤S3：取出EP管将样品冷却至室温，加入混合试剂，再将EP管置于涡旋震荡器上以1500r/min的转速震荡10s充分混合均匀，然后利用低温冷冻离心机在12000rpm、4℃的条件下离心2min；步骤S4：在EP管中加入两倍于上清液体积的提前预冷的无水乙醇，上下颠倒使得乙醇和上清液完全混合均匀，然后利用低温冷冻离心机在12000rpm、4℃的条件下离心5min；步骤S5：弃掉上清液后加入提前预冷的体积分数为70%的乙醇进行洗涤，再利用低温冷冻离心机在12000rpm、4℃的条件下离心2min将乙醇弃掉或者用移液管将乙醇吸出；步骤S6：开盖待乙醇完全挥发后加入灭菌的超纯水溶解过夜，并于-20℃保存备用。本专利技术通过对传统酚-氯仿法提取基因组DNA的部分步骤进行改进，对不同条件下各组提取的结果进行了紫外分光光度和琼脂糖凝胶电泳两种方法的鉴定，最终筛选出高效率利用酚-氯仿法提取鲤基因组DNA的方法，即溶液混匀方式由手动摇晃10min改为涡旋震荡10s后，在低温冷冻离心机中以12000rpm、4℃的条件离心2min得到鲤基因组DNA提取物。因此，本专利技术改进了传统酚-氯仿提取方法，大大缩短了实验用时，提高了实验效率。附图说明图1是不同混匀方式凝胶电泳图，对照组表示手动摇晃10min，实验组表示涡旋振荡10s；A、B、C、D表示4个不同样本，每组均有4个样本；M表示DL2000DNAMarker。图2是不同抽提离心时间凝胶电泳图，第1-5组分别表示抽提离心时间为2min、4min、6min、8min、10min；a、b、c、d表示四个样本，每组均有四个样本；M表示DL2000DNAMarker。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本专利技术上述内容实现的技术均属于本专利技术的范围。实施例为优化酚-氯仿法提取鲤基因组DNA的时间条件，本实验根据以上技术原理，拟通过对传统酚-氯仿法提取基因组DNA的部分步骤进行改进，对不同条件下各组提取的结果进行了紫外分光光度和琼脂糖凝胶电泳两种方法的鉴定，以期缩短酚-氯仿法提取鲤基因组DNA的实验用时，提高实验效率。1、实验试剂、仪器和材料实验试剂组织提取液（Tris-Cl10mmol/L、EDTA100mmol/L、NaCl100mmol/L和SDS0.5wt%；实验室配置）、蛋白酶K（10mg/mL）、苯酚：氯仿：异戊醇的混合试剂（体积比25:24:1；北京索莱宝科技有限公司）、无水乙醇（滁州市恒昌化工有限公司）、体积分数70%乙醇、琼脂糖（BiowestAgarose）、LoadingBuffer（Takara公司）、DL2000DNAMarker（Takara公司）、1×TAE缓冲液（实验室配置）、双蒸水、超纯水。实验仪器酚-氯仿法提取鲤基因组DNA时间条件的优化实验：恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司，XMTD-6000）、干式恒温器（杭州奥盛仪器有限公司，MK2000-2E）、低温冷冻离心机（美国BeckmanCoulter公司，AllegraX-30R）、电泳仪（北京市六一仪器厂，DYY-6C）、超微量分光光度计（美国Thermo公司，NanoDrop-2000）、凝胶成像分析系统（美国Bio-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用酚-氯仿法快速提取黄河鲤基因组DNA的方法，其特征在于具体过程为：采用涡旋震荡10s的混合方式将样品与混合试剂混合均匀，其中混合试剂为体积比25:24:1的苯酚、氯仿与异戊醇的混合溶液，再利用低温冷冻离心机在12000rpm、4℃的条件下离心2min，最终提取得到黄河鲤基因组DNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用酚-氯仿法快速提取黄河鲤基因组DNA的方法，其特征在于具体过程为：采用涡旋震荡10s的混合方式将样品与混合试剂混合均匀，其中混合试剂为体积比25:24:1的苯酚、氯仿与异戊醇的混合溶液，再利用低温冷冻离心机在12000rpm、4℃的条件下离心2min，最终提取得到黄河鲤基因组DNA。


2.根据权利要求1所述的利用酚-氯仿法快速提取黄河鲤基因组DNA的方法，其特征在于具体步骤为：
步骤S1：用灭菌后的剪刀剪取黄河鲤新鲜鳍条组织，剪碎后置于灭菌的EP管内备用；
步骤S2：在EP管内加入组织提取液和蛋白酶K，其中组织提取液的成分为：Tris-Cl10mmol/L、EDTA100mmol/L、NaCl100mmol/L和SDS0.5wt%，盖上瓶盖后颠倒混...

【专利技术属性】
技术研发人员：王磊，黄梦璐，乔志刚，于淼，江红霞，张猛，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：河南;41