环状RNA circ-RNF13作为靶位点抑制剂的应用制造技术

本发明专利技术公开了环状RNA circ‑RNF13作为靶位点的抑制剂在制备治疗鼻咽癌紫杉醇增敏药物中的应用。本发明专利技术研究表明，鼻咽癌紫杉醇耐药细胞株中环状RNA circ‑RNF13高表达，予以敲除circ‑RNF13后可增加鼻咽癌细胞的紫杉醇药物敏感性。因此，circ‑RNF13可在制备鼻咽癌紫杉醇增敏药物中作为靶位点，也是临床上预测鼻咽癌患者紫杉醇药物敏感性的分子标志物。机制研究表明，高表达的circ‑RNF13可通过泛素化连接酶TRIM41蛋白促进p53蛋白的泛素化降解导致鼻咽癌细胞紫杉醇耐药。

【技术实现步骤摘要】
环状RNAcirc-RNF13作为靶位点抑制剂的应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及环状RNAcirc-RNF13作为靶位点的抑制剂在制备鼻咽癌紫杉醇增敏药物中的应用。
技术介绍
鼻咽癌是起源于鼻咽部上皮组织的恶性肿瘤，其发病率和死亡率居于头颈部肿瘤前列。目前，鼻咽癌的治疗以放疗为主；对于T1N0M0以上分期的患者，NCCN指南推荐进行放化疗综合治疗。作为目前临床使用最为广泛的化疗药物之一，紫杉醇也被应用于中晚期鼻咽癌患者的治疗中，然而在治疗过程中紫杉醇耐药性的产生极大地限制了其抗癌效果。因此，进一步研究鼻咽癌肿瘤细胞对紫杉醇产生耐药的分子机制，寻找可能的治疗靶点，提高紫杉醇疗效就显得十分迫切。环状RNA（circRNA）是一类广泛存在于多种真核生物体内、通过反向剪接形成的具有闭合环状结构的非编码RNA（Non-codingRNA，ncRNA）分子。最初，circRNA被认为是剪接的异常副产物。伴随着RNA测序技术和生物信息分析的快速发展，数千种类型的circRNAs已经被发现。如Jeck等人使用全基因组RNaseR富集方法在成纤维细胞中检测到25,000个以上的circRNAs；Memczak等人使用RNA测序结合人类白细胞数据库分析，鉴定了人类中1950个circRNAs，小鼠中1903个circRNAs和秀丽隐杆线虫中724个circRNAs；在真菌，植物，和原核生物中也发现了circRNAs表达。除了广泛的表达外，由于circRNA的共价闭环结构和游离末端的缺乏，circRNA比体内线性RNA更稳定，这种稳定性导致circRNA不受RNA外切酶影响且不易降解。不仅如此，circRNA在物种间也显示出高水平的保守性，在小鼠或大鼠的基因组可以检测到大约15,000个人类的circRNA序列。目前已经提出了几种circRNA形成模型，包括ALU直接反向剪接、反向重复互补、外显子套索和由RNA结合蛋白（ADAR，MBL和QKI等）介导的模型。此外，circRNA被发现参与了一些生物学功能：可海绵吸附microRNA并调控其下游靶基因，与蛋白质相互作用以调节基因表达、基因转录和蛋白的翻译。随着研究的进展，越来越多的circRNAs已被证明在各种疾病中起着不可或缺的作用，尤其是肿瘤的发生发展和化疗耐药。如顺铂耐药患者组织和细胞系中下调的Cdr1as可通过调节miR-1270/SCAI信号通路使卵巢癌细胞对顺铂敏感；circPAN3可通过AMPK/mTOR信号通路调节自噬和影响凋亡相关蛋白的表达来促进AML耐药性；hsa_circ_0025202通过miR-182-5p/FOXO3a轴实现了肿瘤抑制和他莫昔芬致敏作用。然而，目前鲜有鼻咽癌中circRNA与紫杉醇敏感性的研究。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种可以用于制备鼻咽癌紫杉醇增敏药物的新靶点。在本研究中，抑制circ-RNF13的表达能增加紫杉醇对鼻咽癌细胞的杀伤力。在本研究中，我们首次发现在鼻咽癌细胞中高表达的circ-RNF13能通过结合TRIM41蛋白和p53蛋白，诱导p53蛋白的泛素化降解。首次证实circ-RNF13是鼻咽癌紫杉醇耐药的关键参与者，是鼻咽癌治疗领域的一种非常有价值的新型生物标志物和治疗靶标。本专利技术提供了环状RNAcirc-RNF13作为靶位点的抑制剂在制备治疗鼻咽癌紫杉醇增敏药物中的应用。本专利技术还提供了环状RNAcirc-RNF13作为靶位点的抑制剂在制备预测鼻咽癌紫杉醇敏感性分子标志物的应用。本专利技术还提供了泛素化连接酶TRIM41在制备治疗鼻咽癌紫杉醇增敏药物中的应用。本专利技术对鼻咽癌两对细胞株CNE-1亲本株和相对应的紫杉醇耐药细胞株（CNE-1/P和CNE-1/T）、HNE-2亲本细胞系以及相对应的紫杉醇耐药细胞系（HNE-2/P和HNE-2/T）行circRNA微阵列分析筛查，发现circ-RNF13在两对细胞株中均具有差异高表达。我们通过RNaseR酶和放线菌素D来证实circ-RNF13环状结构的稳定性；qRT-PCR和RNA荧光原位杂交证实circ-RNF13在细胞核和细胞质中均有分布，主要分布在细胞质中。体内外实验均证实circ-RNF13可促进鼻咽癌细胞紫杉醇耐药。本专利技术进一步研究circ-RNF13调控鼻咽癌细胞紫杉醇耐药的具体分子机制，通过FISH/IF双染荧光原位杂交、co-IP实验、IP实验及泛素化实验表明，circ-RNF13可介导p53蛋白泛素化降解。体外实验表明下调p53表达可促进鼻咽癌细胞紫杉醇耐药；过表达p53可逆转鼻咽癌细胞紫杉醇耐药。我们通过catRAPID和Ubibroswer网站的预测，结合RIP实验、RNApulldown实验、co-IP实验、IP实验及泛素化实验，成功鉴定出泛素连接酶TRIM41蛋白可与circ-RNF13结合，并调控p53蛋白泛素化降解。过表达circ-RNF13降低了鼻咽癌紫杉醇耐药细胞株中p53蛋白表达水平，而敲低TRIM41后恢复了p53蛋白表达水平。MTT实验、细胞划痕修复实验、细胞侵袭实验和细胞凋亡实验进一步证实了TRIM41可介导circ-RNF13所致的鼻咽癌细胞紫杉醇耐药。我们发现TRIM41的RNA和蛋白质水平在鼻咽癌亲本细胞株与相应的紫杉醇耐药细胞株之间无差异；p53的RNA水平虽然没有差异，但与亲本细胞株相比，CNE-1/T和HNE-2/T细胞中的p53蛋白水平显著降低。并且过表达或敲低circ-RNF13都不影响TRIM41的RNA和蛋白质表达水平；而circ-RNF13的表达水平虽与p53的mRNA水平无关，但与p53蛋白水平呈负相关。总之，本专利技术首次发现在鼻咽癌细胞中，circ-RNF13可与TRIM41蛋白和p53蛋白结合，通过TRIM41蛋白介导p53蛋白的泛素化降解，下调p53蛋白水平，进而促进鼻咽癌细胞紫杉醇耐药。Circ-RNF13可在制备鼻咽癌紫杉醇增敏药中作为靶位点，也是临床上预测鼻咽癌患者紫杉醇药物敏感性的的分子标志物，可能是一种新的改善鼻咽癌患者治疗和生存的策略。同时，TRIM41也作为靶位点在制备治疗鼻咽癌药物中应用。附图说明图1：circ-RNF13在鼻咽癌紫杉醇耐药细胞株中高表达。（a-b）相比于亲本株，同时在CNE-1和HNE-2紫杉醇耐药细胞株中高表达的circRNA有42个，低表达的circRNA有15个。筛选阈值为|倍数变化|≥1.5和P<0.05。（c）在42个显著高表达的circRNA中，有5个circRNA是来源于同一个母本基因RNF13（红色标记）。（d）qRT-PCR检测hsa_circ_0006801，hsa_circ_0067717，hsa_circ_0006697，hsa_circ_0067716和hsa_circ_0001346和hsa_circ_0001346在鼻咽癌细胞亲本株和紫杉醇耐药细胞株中的表达。hsa_circ_0067717差异最为显著。（e）circ-RNF13的模式图（hsa_ci本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.环状RNA circ-RNF13作为靶位点的抑制剂在制备治疗鼻咽癌紫杉醇增敏药物中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.环状RNAcirc-RNF13作为靶位点的抑制剂在制备治疗鼻咽癌紫杉醇增敏药物中的应用。


2.环状RNAcirc-RNF13作...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹科，程雅新，何东，陈兴宇，王占旺，张瑶，陈浩田，
申请(专利权)人：中南大学湘雅三医院，
类型：发明
国别省市：湖南;43