用于生产视网膜色素上皮细胞片层的方法技术

本发明专利技术涉及用于生产视网膜色素上皮细胞片层的方法。本发明专利技术提供了生产细胞片层的方法，该细胞片层包含视网膜色素上皮细胞层和血管形成细胞层，该方法包含层压视网膜色素上皮细胞层和血管形成细胞层的步骤，该血管形成细胞层由具有血管形成能力的血管构成细胞或干细胞组成，并且提供了由该方法获得的细胞片层。本发明专利技术还提供了用于移植的细胞片层，其包含用通过体外诱导干细胞或祖细胞获得的视网膜色素上皮细胞形成的细胞层、从这些细胞分泌的基底膜、以及由具有血管形成能力的血管构成细胞或干细胞所构成的血管形成细胞层。细胞或干细胞所构成的血管形成细胞层。细胞或干细胞所构成的血管形成细胞层。

【技术实现步骤摘要】
用于生产视网膜色素上皮细胞片层的方法
[0001]本申请是申请日为2013年8月23日的中国专利申请201380051245.0“用于生产视网膜色素上皮细胞片层的方法”的分案申请。


[0002]本专利技术涉及细胞片层的生产方法，其包含层压视网膜色素上皮细胞层和在移植后构成血管的细胞层。本专利技术还涉及用于移植的细胞片层，其包含从视网膜色素上皮细胞形成的细胞层、基底膜以及在移植后构成血管的细胞层。

技术介绍

[0003]通过移植细胞片层形式的视网膜色素上皮细胞而治疗视网膜变性疾病的方法，该细胞片层形式接近体内形式。例如，正在实施自体组织移植（例如非专利文献1
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3），包括将从年龄相关性黄斑变性患者的视网膜组织切除的视网膜色素上皮细胞的细胞片层（作为脉络膜伴随层）移植到受损黄斑区。源自患者组织的细胞片层是有问题的，这是因为除了移植手术之外，还产生了由于患者视网膜上的切除手术所导致的侵入风险，并发症的发病率高，移植后黄斑功能的改善和稳定保持的有效率低，等等。
[0004]作为利用从体外到体内培养的视网膜色素上皮细胞的方法，无需依赖于采集患者视网膜，使用通过在人工膜或羊膜上培养视网膜色素上皮细胞而获得的用于移植的细胞片层，以便掩盖很脆弱的单层上皮的刚度不足，这种方法是已知的。然而，人工膜是不适合移植的，因为它在组成、性质、刚度等方面不同于通过视网膜色素上皮细胞本身体内产生的基底膜，并且容易引起与其相关的炎症和排斥。与此相关，本专利技术人报导了容易形成由从体外到体内培养的视网膜色素上皮细胞和细胞本身所产生的基底膜所构成的细胞片层的方法（例如，专利文献1等）。由于通过该方法获得的细胞片层具有由活体类似的那些组分构成的基底膜，因此它很容易植入、具有刚性、在处理性方面优异并优选用于移植治疗。
[0005]视网膜色素上皮细胞病有时会发展出脉络膜纤维化和萎缩作为并发症，以及脉络膜微血管的不足，并显示出无法供应营养物给视网膜色素上皮和视觉细胞。具有基底膜的视网膜色素上皮细胞片层在这些症状中的移植带来一个问题，即所希望的治疗效果由于缺乏脉络膜微血管而难以实现，其妨碍了移植后对视网膜色素上皮细胞充足的营养物和氧供应以及所移植的细胞体内功能的充分展示。
[0006]另一方面，作为利用血管再生的治疗方法，包括移植内皮祖细胞、形成体内血管并治疗视网膜疾病的方法是已知的。例如，专利文献2报导了注射到玻璃体中的骨髓来源的内皮祖细胞定位于视网膜星形胶质细胞中，并入到血管中以形成正常的视网膜血管。然而，通过专利文献2的方法，经利用星形胶质细胞对内皮祖细胞的定位而再生了视网膜血管，但是不可能形成脉络膜血管来保护分开定位的视网膜色素上皮细胞和视觉细胞。
[0007][文献列表][专利文献]专利文献1：WO2011/142364
专利文献2：JP
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A
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2005
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538742[非专利文献]非专利文献1：Am J Ophthalmol.2012年1月; 153(1):120
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7非专利文献2：Acta Ophthalmol.2011年9月; 89(6):e490
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5非专利文献3：Br J Ophthalmol.2011年3月; 95(3):370
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5。

技术实现思路

[0008]专利技术要解决的技术问题本专利技术的问题是研发方便且稳定地不使用人工膜来生产视网膜色素上皮细胞片层的新方法，从而提供用于移植的视网膜色素上皮细胞片层，其显示出高植活率以及功能性方面的优异，即使是对于患有诸如脉络膜视网膜变性疾病，特别是高度近视、严重葡萄膜炎等与脉络膜视网膜萎缩相关疾病的患者。
[0009]解决问题的手段本专利技术人已进行了深入的研究，并研发出了细胞片层的生产方法，其包含层压视网膜色素上皮细胞层和在移植后具有形成血管的能力的细胞。他们已经发现，通过这样的方法所获得的细胞片层同时包含视网膜色素上皮细胞层和血管形成细胞层两者，并且因此，当移植给患者时，它不仅重建了视网膜组织，而且通过血管形成重建了脉络膜，以及对于治疗脉络膜视网膜变性疾病，特别是与脉络膜病相关的视网膜变性疾病是有用的。此外，当通过在胶原凝胶层上铺板视网膜色素上皮细胞并将其培养而制备视网膜色素上皮细胞层时，所获得的视网膜色素上皮细胞层保持了胶原凝胶和视网膜色素上皮细胞片层之间的基底膜，具有细胞因子分泌能力和类似于体内视网膜色素上皮细胞的那些的细胞之间的粘附性，该视网膜色素上皮细胞层可以很容易地通过用胶原酶分解胶原凝胶而与细胞培养基材分开，同时保留基底膜。另外，构成视网膜色素上皮细胞层的细胞保持了视网膜色素上皮细胞特异性标志物的表达。基于这些发现，他们已经进行了进一步的研究，并完成了本专利技术。因此，本专利技术提供了以下内容：[1] 生产细胞片层的方法，所述细胞片层包含视网膜色素上皮细胞层和血管形成细胞层，所述方法包含层压视网膜色素上皮细胞层和血管形成细胞层的步骤。
[0010][2] [1]的生产方法，其中层压视网膜色素上皮细胞层和血管形成细胞层，使得血管形成细胞层接触视网膜色素上皮细胞层的基底面。
[0011][3] [1]或[2]的生产方法，其中血管形成细胞层是由选自由成血管细胞、血管内皮祖细胞和血管内皮细胞组成的组的至少一种细胞所构成的。
[0012][4] [1]或[2]的生产方法，其中血管形成细胞层是由源自要用该细胞片层移植的患者的组织或细胞、或者源自具有与该患者HLA型匹配的HLA型的供体的细胞所构成的。
[0013][5] [1]‑
[4]任一项的生产方法，其中视网膜色素上皮细胞层是通过包含以下步骤的方法所生产的细胞片层：（1）将视网膜色素上皮细胞接种并培养在胶原凝胶上以形成由视网膜色素上皮细胞构成的细胞片层，以及（2）用胶原酶降解胶原凝胶以分离由视网膜色素上皮细胞构成的细胞片层。
[0014][6] [1]‑
[5]任一项的生产方法，其中视网膜色素上皮细胞是通过诱导ES细胞、
iPS细胞或祖细胞的分化而获得的。
[0015][7] [1]‑
[6]任一项的方法生产的细胞片层。
[0016][8] 用于移植的细胞片层，所述细胞片层包含用通过从体外到体内诱导干细胞或祖细胞的分化而获得的视网膜色素上皮细胞形成的细胞层、从所述细胞分泌的基底膜、以及血管形成细胞层。
[0017]专利技术效果根据本专利技术，有可能容易且稳定地生产层压的视网膜色素上皮细胞片层，其具有能够补充活体中所缺乏的脉络膜血管并在移植后给视网膜供应氧气和营养物的血管构成细胞层。本专利技术的细胞片层是非常有用的，因为它在植活率和功能性方面是优异的，并且还可以治疗严重的脉络膜视网膜变性疾病，对此，简单的视网膜色素上皮细胞移植并不能容易地提供充分的治疗效果，诸如脉络膜视网膜变性疾病，特别是高度近视和严重葡萄膜炎等，它们与脉络膜视网膜萎缩相关。
附图说明
[0018]图1显示了移植有本专利技术的细胞片层的宿主组织切片本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.生产细胞片层的方法，所述细胞片层包含视网膜色素上皮细胞层和血管形成细胞层，所述方法包括层压视网膜色素上皮细胞层和血管形成细胞层的步骤，其中所述血管形成细胞层是由血管内皮祖细胞构成。2.根据权利要求1所述的生产方法，其中层压所述视网膜色素上皮细胞和血管形成细胞层，使得所述血管形成细胞层接触所述视网膜色素上皮细胞层的基底面。3.根据权利要求1或2所述的生产方法，其中所述血管形成细胞层是由源自要用所述细胞片层移植的患者的组织或细胞、或者源自具有与所述患者HLA型匹配的HLA型的供体的细胞构成。4.根据权利要求1至3中任一项所述的生产方法，其中所述视网膜色素上皮细胞层是...

【专利技术属性】
技术研发人员：高桥政代，镰尾浩行，
申请(专利权)人：独立行政法人理化学研究所，
类型：发明
国别省市：