一种外泌体分离的快速提取试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种外泌体分离的快速提取试剂盒，具体涉及生物技术领域，本发明专利技术通过采用羟基磷灰石纯化柱可以提取过滤液，此溶液即为溶于PBS的外泌体，采用该试剂盒可以快速的从血清、血浆和细胞培养上清中提取外泌体，满足了高效提取的需求，同时本方法操作简单，无需超离或重复离心法即可完成抽提和纯化，大大缩短了纯化时间，而且回收率更为稳定，采用此方式可以从2

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体分离的快速提取试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物
，更具体地说，本专利技术涉及一种外泌体分离的快速提取试剂盒。

技术介绍

[0002]外泌体是一种小膜泡，其包含复杂的RNA和蛋白质，在正常及病理状态下，多种细胞均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外，在电子显微镜下，可见外泌体由双层磷脂分子包裹，形态呈扁形或球形小体，有些为杯状；其在体液中的存在形式以球形结构为主，通常可在蔗糖密度梯度溶液中密度1.13～1.19g/ml的范围获得富集，目前认为外泌体可由各种类型的细胞分泌，发源于细胞内吞系统中的晚期内体。
[0003]外泌体在外周血、尿液、唾液、腹水和羊水等体液中具有很高的丰度，而不同组织来源的外泌体在组成和功能方面存在差异，同时这种差异受到细胞外基质和微环境的动态调控，肿瘤来源或肿瘤相关的外泌体是调控肿瘤发生发展的重要机制，对肿瘤外泌体的分析和检测可以辅助肿瘤的早期诊断、疗效评价和预后分析，此外，外泌体及其修饰加工产物还可以作为基因或药物的有效载体，用于肿瘤治疗。
[0004]而外泌体在进行纯化的过程中，通常采用的纯化方法为超离法、低速离心或采用高速离心交替进行纯化，而后即可分离到大小相近的囊泡颗粒，采用超离法纯化操作过程比较简单，而且获得的囊泡数量较多，进而广受欢迎，但是其过程所耗费的时间较长，且回收率不稳定，此外，采用多次交替离心的操作，很可能对获取的囊泡颗粒造成损害，从而降低其质量，并且以上两种方式，均会影响整体纯度，对细胞外泌体的后续应用及研究造成很大影响，所以有必要对现有的细胞外泌体提取方法进行改进，以解决细胞外泌体纯度低的问题。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的上述缺陷，本专利技术提供了一种外泌体分离的快速提取试剂盒，本专利技术所要解决的技术问题是：采用超离法纯化过程所耗费的时间较长，且回收率不稳定，此外，采用多次交替离心的操作，很可能对获取的囊泡颗粒造成损害，从而降低其质量，并且以上两种方式，均会影响整体纯度的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种外泌体分离的快速提取试剂盒，包括溶液a、溶液b、溶液c和纯化柱，所述溶液a的质量为2.5ml，所述溶液b的质量为2.5ml，所述溶液c的质量为10ml，所述纯化柱的数量为10个。
[0007]所述溶液a为Protein A、Protein G或Protein Ni琼脂糖悬液中的一种或两种以上，所述溶液b为TIMD4重组蛋白、TIMD3重组蛋白或Annexin V重组蛋白中的一种或两种以上，所述TIMD4重组蛋白的质量浓度为10
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200ug/uL，所述TIMD3重组蛋白的质量浓度为10
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200ug/uL，所述Annexin V重组蛋白的质量浓度为10
‑
200ug/uL，所述溶液c为结合增强剂，
所述结合增强剂的摩尔浓度为100
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1000mol/L，所述纯化柱为羟基磷灰石纯化柱。
[0008]一种外泌体快速分离和纯化的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
[0009]S1、将需要纯化的外泌体样本使用无血清培养基培养48h，培养48h后将得到的液体进行密度梯度离心，然后再将提纯的液体通过收集管进行高纯度外泌体的收集，结束后收集2ml细胞上清液，以3000g，温度为4℃离心15min，去除细胞上清液中的残留细胞或细胞碎片，然后将离心后的上清液使用0.2μm滤器过滤，并将上清液转移至干净的10ml玻璃试管中，以去除较大的囊泡，并放置于冰上以备后续的使用。
[0010]S2、另取一支干净的10ml玻璃试管，取溶液a0.125ml、溶液b0.125ml和溶液c0.5ml，震荡5
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10s，进行均匀混合，得到0.75ml的abc混合液，并向每2ml的上清液中加入0.75ml的abc混合液，然后利用柱平衡液处理羟基磷灰石纯化柱，使纯化柱上各基团处于活化状态，然后将羟基磷灰石纯化柱加入玻璃试管中。
[0011]S3、盖上管盖，置于振荡器中剧烈震荡30s，并在4℃的温度下孵育30min，使得玻璃试管中的样品形成从低到高连续分布的密度阶层，然后使用提取管吸掉上层或下层溶液，并将剩余样品转入1.5ml的离心管中，以3000
‑
5000g离心3min，使得样品再次形成从低到高连续分布的密度阶层，并弃掉上清与下层溶液，然后将剩余样品转入0.5ml的离心管中，以3000
‑
5000g离心3min，使得样品可以形成3层溶液，并弃掉上层与下层溶液。
[0012]S4、打开离心管盖，放置10min等待自然晾干，然后加入4倍沉淀体积的1
×
PBS，反复吹打重悬沉淀，使其完全分散，于水平摇床上高速孵育5min，再次反复吹打重悬沉淀，使其完全分散，再次置于水平摇床上高速孵育5min，孵育完成之后以5000g离心5min，将上清液吸出来置于纯化柱中，剩余沉淀于4℃保留，将纯化柱以1000g离心5min，收集得到的过滤液，即是溶于PBS的外泌体。
[0013]作为本专利技术的进一步方案：所述S1中对于增殖速度较快的细胞，可以在使用无血清培养基培养之前对其进行1:2的稀释，对于大规模培养的细胞进行检测时，可以先稀释至1
×
10^5cells/ml。
[0014]作为本专利技术的进一步方案：所述S4中吸出上清液的过程中不得吸到沉淀，所述S4中最后得到的溶于PBS的外泌体可继续用于后续实验或于4℃的条件下暂存，长期保存需要在
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80℃的冰箱中，三月内使用即可。
[0015]作为本专利技术的进一步方案：所述羟基磷灰石纯化柱中羟基磷灰石用量为10
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100mg，并经柱平衡液对其进行活化，其中，柱平衡液为1
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10mM NaPO，pH为6.5
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7.5。
[0016]作为本专利技术的进一步方案：所述试剂盒可用于血液、尿液、唾液、积液等体液以及细胞培养液的外泌体提取和纯化。
[0017]作为本专利技术的进一步方案：所述试剂盒可用于人源、大鼠、小鼠、兔子等哺乳动物体液的外泌体提取和纯化。
[0018]本专利技术的有益效果在于：
[0019]本专利技术通过采用羟基磷灰石纯化柱可以提取过滤液，此溶液即为溶于PBS的外泌体，采用该试剂盒可以快速的从血清、血浆和细胞培养上清中提取外泌体，满足了高效提取的需求，同时本方法操作简单，无需超离或重复离心法即可完成抽提和纯化，大大缩短了纯化时间，而且回收率更为稳定，采用此方式可以从2
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4ml细胞上清液中可获得200
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400ng外泌体蛋白或50
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200ng外泌体RNA，使得提取囊泡的富集量大，并且还可以提高提取的纯度，
保障了整体的质量，使得本专利技术还具有成本低、便于保存和运输方便的特点，并且可以适本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外泌体分离的快速提取试剂盒，包括溶液a、溶液b、溶液c和纯化柱，其特征在于：所述溶液a的质量为2.5ml，所述溶液b的质量为2.5ml，所述溶液c的质量为10ml，所述纯化柱的数量为10个；所述溶液a为Protein A、Protein G或Protein Ni琼脂糖悬液中的一种或两种以上，所述溶液b为TIMD4重组蛋白、TIMD3重组蛋白或Annexin V重组蛋白中的一种或两种以上，所述TIMD4重组蛋白的质量浓度为10
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200ug/uL，所述TIMD3重组蛋白的质量浓度为10
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200ug/uL，所述Annexin V重组蛋白的质量浓度为10
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200ug/uL，所述溶液c为结合增强剂，所述结合增强剂的摩尔浓度为100
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1000mol/L，所述纯化柱为羟基磷灰石纯化柱。2.根据权利要求1所述的一种外泌体快速分离和纯化的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将需要纯化的外泌体样本使用无血清培养基培养48h，培养48h后将得到的液体进行密度梯度离心，然后再将提纯的液体通过收集管进行高纯度外泌体的收集，结束后收集2ml细胞上清液，以3000g，温度为4℃离心15min，去除细胞上清液中的残留细胞或细胞碎片，然后将离心后的上清液使用0.2μm滤器过滤，并将上清液转移至干净的10ml玻璃试管中，以去除较大的囊泡，并放置于冰上以备后续的使用；S2、另取一支干净的10ml玻璃试管，取溶液a0.125ml、溶液b0.125ml和溶液c0.5ml，震荡5
‑
10s，进行均匀混合，得到0.75ml的abc混合液，并向每2ml的上清液中加入0.75ml的abc混合液，然后利用柱平衡液处理羟基磷灰石纯化柱，使纯化柱上各基团处于活化状态，然后将羟基磷灰石纯化柱加入玻璃试管中；S3、盖上管盖，置于振荡器中剧烈震荡30s，并在4℃的温度下孵育30min，使得玻璃试管中的样品形成从低到高连续分布的密度阶层，然后使用提取管吸掉上层或下层溶液，并将剩余样品转入1.5ml的离心管中，以30...

【专利技术属性】
技术研发人员：宣之胜，李亚楠，范崇飞，崔峰，盛一，高博，
申请(专利权)人：上海宇玫博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：