一种基于pH响应的DNA纳米机器建立可编程细胞间通讯的方法技术

本发明专利技术提供一种基于pH响应的DNA纳米机器建立可编程细胞间通讯的方法，使用三链DNA结构使细胞表面功能化，赋予细胞响应pH变化的功能而进行细胞组装，固定在细胞表面的三链DNA纳米结构可以响应生理条件下的pH变化，实现三链结构与双链结构的相互转换，从而连接上另一组通过互补ssDNA修饰的细胞。根据本发明专利技术提供的一种基于pH响应的DNA纳米机器建立可编程细胞间通讯的方法，利用三链DNA结构赋予细胞可编程pH响应型通讯的能力，具有用量少、操作简便快速和灵敏度高等优点。便快速和灵敏度高等优点。便快速和灵敏度高等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于pH响应的DNA纳米机器建立可编程细胞间通讯的方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，更具体地涉及一种基于pH响应的DNA 纳米机器建立可编程细胞间通讯的方法。

技术介绍

[0002]细胞间的通讯可以通过细胞识别来调控生理和病理过程，目前已经能够通过多种纳米材料，如仿生聚合物，ssDNA和框架核酸来实现人为编程和调控细胞通讯。但是，目前仍未实现响应外界刺激而导致的信息分子的传递。因此，利用pH值变化等胞外微环境触发的人工仿生系统，可以促进细胞增殖和迁移，促进药物高效传递。DNA在细胞膜工程化中显示出巨大的优势，通过DNA杂交反应，可以方便地构建同质或者是异质细胞群。三链DNA由于其对pH精确的响应性，已被广泛的应用于pH纳米传感器和药物释放纳米机器中。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种基于pH响应的DNA纳米机器建立可编程细胞间通讯的方法，从而解决现有技术仍未实现响应外界刺激而导致的信息分子的传递的问题。
[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0005]提供一种基于pH响应的DNA纳米机器建立可编程细胞间通讯的方法，包括以下步骤：S1：提供一种含有60％TAT的三链DNA结构，所述三链DNA 结构的5
’
端修饰由数个碱基形成的ssDNA
‑
1，茎环结构中插有淬灭基团BHQ1； S2：提供一种细胞，并在细胞膜上插入胆固醇修饰的与所述三链DNA结构5
’
端的ssDNAr/>‑
1互补配对的ssDNA
‑
2，将该细胞与来自步骤S1的三链DNA结构混合孵育后，通过测量细胞的荧光强度，分析细胞在不同pH环境下的荧光强度变化，确定所述三链DNA结构成功锚定在细胞膜上，并且具有可开关的特性；S3：将锚定了所述三链DNA结构的细胞与另一组修饰了ssDNA
‑
2的细胞进行共孵育，通过流式细胞荧光分选技术确定不同pH环境下细胞的组装效率；S4：将所述三链DNA结构拆分为一个茎环结构和一条ssDNA
‑
1，分别利用胆固醇修饰固定在细胞膜上，并且在不同pH环境下将两组细胞进行共孵育，通过流式细胞荧光分选技术确定细胞组装效率；S5：对步骤S4的其中一组细胞使用CellTracke DeepRed进行胞质染色，经三链DNA结构介导的细胞组装后，通过共聚焦荧光显微镜分析邻近细胞的胞内荧光强度即可确定细胞间的分子传递。
[0006]步骤S2包括：通过检测AL488的荧光强度在pH6.5
‑
7.5之间的变化来测试所述三链DNA结构在细胞膜上开关的可逆性。
[0007]步骤S3和步骤S4均包括：使用流式细胞仪对细胞进行分选，统计488 纳米和633纳米通道双阳性的细胞群体数量并成像。
[0008]步骤S5包括：荧光分析时所采用的激发光波长为633纳米，记录 650
‑
690纳米处的荧光发射强度。
[0009]根据本专利技术，首先要提供一种含有60％TAT三链结构的DNA纳米开关，可通过荧光
共振能量转移来表征DNA纳米开关的pH响应性。应当知晓的是， 60％TAT结构开关示意图参考如下式所示(J Am Chem Soc,2019,141, 18910
‑
18915)，即开关部分含T
‑
A
·
T互补配对的结构占比为60％，该占比直接决定三链DNA的pH响应范围，该三链DNA结构的设计属于本领域公开的技术，具体设计方法可参考文献J Am Chem Soc,2014,136,5836
‑
5839.。pH环境可以为4.5，5.1，5.5，6.1，6.5，6.8，7.1，7.5，8.0，8.5和9.4。
[0010][0011]应当理解的是，细胞膜修饰DNA的方法为本领域的公知技术，具体方法可参考文献(J Am Chem Soc,2020,142,8800
‑
8808.)。如图1中的a和b所示，两个深色小球分别代表两组进行不同DNA修饰的细胞，虚线框内放大了细胞膜上DNA在不同pH环境下(a：pH7.5，b：pH6.5)的结构状态。
[0012]根据本专利技术的一个优选方案，步骤S1中所述的三链DNA结构的序列自5
’‑3’
为： AAGGAAGAAGTTT(BHQ
‑
1)ACTTCTTCCTTCTTTGTTCCTTCTTC
‑
AlexaFlour488，其中，3
’
端修饰了pH不敏感的基团Alexa Flour488，茎环结构中插入了淬灭基团BHQ1。
[0013]步骤S1中提供的所述三链DNA结构的5
’
端碱基数量优选为20～30个。
[0014]根据本专利技术的一个优选方案，所述三链DNA结构5
’
端延长的ssDNA
‑
1 的碱基序列为ACCACCACCACCACCACCAA。当pH小于6.5时，荧光基团和淬灭基团靠近，细胞膜上荧光强度低，当pH大于7.5时，荧光基团远离淬灭基团，荧光强度增高。
[0015]正如本专利技术的
技术介绍
部分所述，现有技术忽略了细胞的环境响应型通讯，而本专利技术的创造性即主要体现在步骤S3，S4以及S5，通过这些步骤赋予了细胞响应环境pH变化进行自组装的功能，并在自组装后产生通讯的能力。
[0016]根据本专利技术提供的方法，使用三链DNA结构使细胞表面功能化，赋予细胞响应pH变化的功能而进行细胞组装，固定在细胞表面的三链DNA纳米结构可以响应生理条件下的pH变化，实现三链结构与双链结构的相互转换，从而连接上另一组通过互补ssDNA修饰的细胞。
[0017]综上所述，根据本专利技术提供的一种基于pH响应的DNA纳米机器建立可编程细胞间通讯的方法，利用三链DNA赋予细胞可编程pH响应型通讯的能力，具有用量少、操作简便快速和灵敏度高等优点。
附图说明
[0018]图1为本专利技术实施例1中得到的细胞膜上DNA纳米开关的pH响应性表征结果；其中，a为使用三链DNA纳米器件的细胞表面工程示意图；b示出了通过流式细胞分选技术监测的三链DNA的pH依赖性，记录AL488的平均荧光强度；c示出了在生理条件(pH 7.5)和酸性环境
(pH 6.5)之间，DTNs 对Ramos细胞的pH依赖性；d示出了三链DNA纳米开关在细胞膜上的可逆构象变化；
[0019]图2为本专利技术实施例2和实施例3中，通过三链DNA在不同pH环境下得到的细胞团分析图；其中，a和d分别为在生理条件下(pH 7.5)和酸性条件下(pH 6.5)基于三链DNA的细胞组装示意图；b和e分别为在两个不同 pH值下的细胞组装的流式细胞分选技术分析；c和f分别为由两组Ramos细胞构建的细胞图案(分别用红色或绿色荧光素染色)；
[0020]图3为本专利技术实施例4中pH本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于pH响应的DNA纳米机器建立可编程细胞间通讯的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：提供一种含有60％TAT的三链DNA结构，所述三链DNA结构的5
’
端修饰由数个碱基形成的ssDNA
‑
1，茎环结构中插有淬灭基团BHQ1；S2：提供一种细胞，并在细胞膜上插入胆固醇修饰的与所述ssDNA
‑
1互补配对的ssDNA
‑
2，将该细胞与来自步骤S1的三链DNA结构混合孵育后，通过测量细胞的荧光强度，分析细胞在不同pH环境下的荧光强度变化，确定所述三链DNA结构成功锚定在细胞膜上，并且具有可开关的特性；S3：将锚定了所述三链DNA结构的细胞与另一组修饰了ssDNA
‑
2的细胞进行共孵育，通过流式细胞荧光分选技术确定不同pH环境下细胞的组装效率；S4：将所述三链DNA结构拆分为一个茎环结构和一条ssDNA
‑
1，分别利用胆固醇修饰固定在细胞膜上，并且在不同pH环境下将两组细胞进行共孵育，通过流式细胞荧光分选技术确定细胞组装效率；S5：对步骤S4的其中一组细胞使用CellTracke DeepRed进行胞质染色，经三链DNA结构介导的细胞组装后，通过共聚焦荧光显微镜分析邻近细胞的胞内荧光强度即可确定细胞间的分子传递。2.根据权利要求1所述的基于pH响应的DNA纳米机器建立可编程细胞间通讯的方法，其特征在于，步骤S2包括：通过检测AL488的荧光强度在pH6.5
‑
7.5之间的变化来测试所述三链DNA结构在细胞膜...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊春海，王丽华，侯军军，赵紫微，葛志磊，李茜，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：