一株拟无枝酸菌突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及微生物技术领域，公开了一株拟无枝酸菌突变体及其应用。本发明专利技术所述拟无枝酸菌突变体保藏编号为CCTCC NO：M2019756。本发明专利技术提供了一株通过等离子诱变筛选获得的拟无枝酸菌突变体CFFSH012，其在具备较高的阿魏酸转化率时，也同时具备提高香兰素产量的能力，可同时满足生产效率与成本水平的需求，可为发酵香兰素产业提供重要的经济价值。酵香兰素产业提供重要的经济价值。

【技术实现步骤摘要】
一株拟无枝酸菌突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物
，具体涉及一株拟无枝酸菌突变体及其应用。

技术介绍

[0002]香兰素(化学名称:3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，FEMA Number 3107)是一种使用量巨大的重要香料。香兰素的分子量为152.1，具有香荚兰豆香气及浓郁的奶香，起增香和定香作用。香兰素的天然来源是源于多年生的草本植物的香荚兰的提取。然而，香荚兰种植3年后方能采摘收取其香豆荚，并且其香豆荚内的香兰素含量大约只有1.5％到3％(干重含量)。另外，受到热带植物香荚兰气候、土壤的地域性限制，全球约90％的香荚兰产于热带岛屿马达加斯加的大溪地地区。香荚兰豆等天然香草植物的种植、采收、提取和制备过程需要大量的劳工、土地与时间，使得其成本是化学合成产品的100多倍，因此天然香兰素产品价格也是合成产品的50～200倍。因此从天然植物中提取的香兰素产品在全球产量中的占比不到1％，多数的香兰素依赖于不可再生的石油化工产品邻甲氧基苯酚和4-甲基愈创木酚通过人工化学合成获得的人造香料。
[0003]随着社会对于天然和有机的生活方式的关注程度不断增加，天然香料越来越受到消费者的喜欢。在日化领域，天然有机护肤产品不仅其添加的植物提取物必须要获得有机认证的，同时产品中不能添加人工香料，因此只能采用天然香料的成份。另外，在食品领域，有机食品的认证规则中也规定了有机食品类不得使用人工香料。欧盟法规(EU Directive 88/388/CEE)及美国FDA法规(CFR-21CFR101.22)将以天然来源的原料通过酶处理或者是微生物发酵方式及其他传统食品加工方式获取的香料也纳入了天然香料的法律定义中。
[0004]美国专利Process for the preparation of vanillin and microorganisms suitable therefor(US Patent NO.6,133,003)公开了利用拟无知酸菌DSM9992(Amycolatopsis sp.DSM 9992)或拟无知酸菌DSM9991转化阿魏酸生产香兰素的方法。阿魏酸是一种来自于天然谷物谷壳提取的天然可再生物质可再生原料，因此以该方法获取的香兰素符合天然香料的法律定义。在该专利的公开的最优结果(实施实例3)中，累积224.92g阿魏酸被投入发酵罐发酵转化，生物转化结束时共获取香兰素129.835g(浓度11.5g/L)，摩尔转化率为73.66％。如果考虑反应结束时，反应液中尚残留1g/L阿魏酸未参与转化反应，扣除未参与反应的阿魏酸，实际上的摩尔转化率应为77.5％(专利中记载值为77.8％)。
[0005]美国专利Microbiological process for producing vanillin(US Patent NO.6,235,507)公开了一种利用西塘链霉菌ATCC 39116(保藏名称Streptomyces setonii ATCC 39116)转化阿魏酸生产香兰素的方法。在该专利所公开的方案中，5至40g/L(终浓度)的阿魏酸被加入到培养基中，并利用菌体的发酵转化为香兰素，在其公开的若干个方案中阿魏酸转化为香兰素的摩尔转化率为51-75％之间。在专利中公开的最优方案(实施实例4)中香兰素产量达到13.9g/L(阿魏酸的摩尔转化率为75％)。另外，西塘链霉菌ATCC 39116根据其16s rRNA的全长序列比对后，重新鉴定为拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)，因此西塘链霉菌ATCC 39116实质上就是拟无枝酸菌ATCC 39116的曾用名，菌株信息变更情况记载于
美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)网站，在有关菌株Amycolatopsis sp.(39116
TM
)的有关介绍条目中以及该菌株的产品手册(Product sheet)中。
[0006]中国专利一株链霉菌及利用其生物转化阿魏酸生产香兰素的方法(公开号CN 101165168A)公开了一种利用链霉菌CCTCC M 206065(Streptomyces sp.CCTCC M 206065转化阿魏酸生产香兰素的方法，在其公开最优技术方案(实施实例10)中阿魏酸溶液在发酵的不同阶段以优化的流加方式及速度流加至发酵体系中(阿魏酸累积终浓度达45g/L)，同时在加入DM11大孔吸附树脂以减少香兰素和阿魏酸对细胞的毒害及抑制作用，最终实现香兰素的产量达到19.2g/L(阿魏酸转化为香兰素的摩尔转化率为54.5％)。
[0007]美国专利Amycolatopsis sp.strain and methods of using the same for vanillin production(US Patent NO.9,758,759)公开了一种利用拟无枝酸菌CCTCC NO:M 2011265(Amycolatopsis sp.CCTCC NO:M 2011265)转化阿魏酸生产香兰素的技术方案，在其公开的最优技术方案中Amycolatopsis sp.zhp06菌株细胞(即Amycolatopsis sp.CCTCC NO:M 2011265)其可将初始浓度30g/L的阿魏酸转化为产量达10.03g/L的香兰素(摩尔转化率为43.8％)或将初始浓度40g/L的阿魏酸转化为10.08g/L的香兰素(摩尔转化率为34.46％)。
[0008]美国专利Microorganisms and methods for producing vanillin(US Patent NO.10,280,407)公开了一种进一步提高拟无枝酸菌香兰素产量及转化率的技术方案，在其技术方案中作为生产菌株的拟无枝酸菌重组菌株的香草醛还原酶或者香醛脱氢酶是无功能的，通过插入失活或者敲除所述的香草醛还原酶或者所述的香醛脱氢酶使得香兰素进一步被还原为香草醇或进一步被氧化为香草酸的支路代谢途径被截断，减少副产物的产生，从而提高香兰素的产量。在其优选的实施方案中作为拟无枝酸菌菌株ATCC 39116的vr1-vr5基因被失活后拟无枝酸菌菌株ATCC 39116的香兰素产量得以提高(原文中并未记载香兰素的产量与转化率，仅以“+”数量表示产量多数)。
[0009]在已经公开的现有技术中，拟无枝酸菌属，特别是拟无枝酸菌菌株ATCC39116被公认为是现有已知现有微生物中利用阿魏酸转化为香兰素能力最强的菌株，具有非常好的产业化应用价值。由于要满足欧盟法规(EU Directive88/388/CEE)及美国FDA法规(CFR-21CFR101.22)的天然香料要求，作为原料的阿魏酸本身首先必须是天然的，源于谷壳提取的阿魏酸的成本依旧较高，占到了所有发酵原料成本的70％以上，对香兰素的成本影响比重较大。因此更高的阿魏酸转化率则意味则更好的阿魏酸利用率及更低的生产成本。同时，更高的香兰素产量意味着拥有更高的生产效率，二者均非常重要。因此，有大量的尝试被投入到对拟本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株拟无枝酸菌突变体，保藏编号为CCTCC NO：M2019756。2.保藏编号为CCTCC NO：M2019756的拟无枝酸菌突变体在发酵生产香兰素中的应用。3.保藏编号为CCTCC NO：M2019756的拟无枝酸菌突变体在制备用于发酵生产香兰素中的微生物产品中的应用。4.一种发酵生产香兰素的方法，其特征在于，以阿魏酸为发酵底物，采用保藏编号为CCTCC NO：M2019756的拟无枝酸菌突变体进行发酵。5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，保藏编号为CCTCC NO：M2019756的拟无枝酸菌突变体活化后，用种子培养基制备种子液，然后接种至发酵培养基中发酵，发酵过程中补加碳源、氮源和阿魏酸。6.根据权利要求4或5所述方法，其特征在于，所述发酵的初始条件为：温度：45℃；通气比：1vvm；流加氢氧化钠控制pH值：7.2；菌体生长阶段溶氧35％～50％，罐压：0.05Mpa；搅拌转速：溶氧联动调节...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛凯，杜喜林，张丽莎，张鹏，何汉平，
申请(专利权)人：波顿上海生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：