基于拉曼光谱的多药耐药肿瘤细胞鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种基于拉曼光谱的多药耐药肿瘤细胞鉴定方法，包括以下步骤：1)制备拉曼增强基底；2)拉曼增强基底上偶联可与多药耐药肿瘤细胞特异性结合的药物；3)构建多种多药耐药肿瘤细胞的拉曼光谱的特征指示峰数据库：4)待测肿瘤细胞的鉴定：根据待检测的肿瘤细胞的拉曼光谱中特征指示峰的出现情况判定是否为多药耐药肿瘤细胞。本发明专利技术结合拉曼光谱检测，能在无损的情况下实现对多药耐药肿瘤细胞的快速鉴定，灵敏度高，且能实现液相检测，由于不需要破坏细胞，鉴定出的多药耐药肿瘤细胞能用于后续多药耐药机制研究或个性化药物筛选，本发明专利技术的方法有望在抗肿瘤药物的开发中获得应用。

【技术实现步骤摘要】
基于拉曼光谱的多药耐药肿瘤细胞鉴定方法
本专利技术涉及多药耐药肿瘤细胞鉴定
，特别涉及一种基于拉曼光谱的多药耐药肿瘤细胞鉴定方法。
技术介绍
化学治疗(化疗)是目前肿瘤治疗的主要手段，但其疗效往往受多药耐药现象的限制。这一现象导致不仅化疗药物失效、还会使其对多种结构不同、作用靶点不同的药物产生耐药性，因此成为肿瘤复发、转移以及90％以上化疗患者死亡的主要原因。针对病人的多药耐药肿瘤出现及产生机制进行分析，进而据此进行治疗药物筛选及方案确定对肿瘤治疗具有重要意义。然而，多药耐药肿瘤与常规肿瘤的外观差别不大，临床医生往往需在病人表现出耐药现象后，方可进行切片及细胞分离检测。进而分别从基因、蛋白等方面进行耐药性分析。目前常用的RNA检测方法包括Northernblot、Slotblot、RT-PCR、原位杂交以及基因芯片技术,其中因RT-PCR操作简便安全,特异性及敏感性高而在临床应用较广。在蛋白水平上的检测方法有免疫组化、Westernblot及流式细胞仪。随着单克隆抗体技术的发展,流式细胞仪在监测肿瘤细胞中癌基因表达产物的水平以及研究肿瘤调控因素等方面已日趋成熟，如在结构方面,可检测Mdr1的高表达,在功能方面,检测抗肿瘤药物的细胞内积聚的程度,在判断疗效方面,检测药物在细胞内的重新分配,判断是否在药物作用位点以及直观了解药物对癌细胞动力学的干扰和影响。然而上述方法往往操作复杂，检测周期长，且由于需破坏细胞之后进行检测，所获得的肿瘤细胞也无法用于后续的个性化药物筛选中。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于拉曼光谱的多药耐药肿瘤细胞鉴定方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种基于拉曼光谱的多药耐药肿瘤细胞鉴定方法，包括以下步骤：1)制备拉曼增强基底；2)在步骤1)得到的拉曼增强基底上偶联可与多药耐药肿瘤细胞特异性结合的药物；3)针对多种类型的肿瘤细胞分别按如下方法获取对应的多药耐药肿瘤细胞的拉曼光谱的特征指示峰，从而构建多种多药耐药肿瘤细胞的拉曼光谱的特征指示峰数据库：将同一种类肿瘤细胞的多药耐药肿瘤细胞和正常肿瘤细胞分别与步骤2)得到的拉曼增强基底共同孵育，然后对与两种肿瘤细胞分别供孵育后的两个拉曼增强基底进行拉曼检测，从而获得多药耐药肿瘤细胞对应的拉曼光谱R1和正常肿瘤细胞对应的拉曼光谱R2，将R1和R2进行比较，获得至少一个在R1中存在而R2中不存在的区别峰，然后从所有区别峰中至少选择一个作为用于指示存在多药耐药肿瘤细胞的特征指示峰T；4)待测肿瘤细胞的鉴定：将待检测的肿瘤细胞与步骤2)得到的拉曼增强基底共同孵育，取出拉曼增强基底后进行拉曼检测，得到待检测的肿瘤细胞的拉曼光谱Rx，根据待检测的肿瘤细胞的种类，在步骤2)获得的拉曼光谱的特征指示峰数据库中获取相同种类的肿瘤细胞所对应的多药耐药肿瘤细胞的所有特征指示峰数据Tn，在Rx中查找出现的包含于Tn中的特征指示峰的数量，记为X；若X≥A*N，则判定待检测的肿瘤细胞为多药耐药肿瘤细胞，否则为正常肿瘤细胞，其中，N表示Tn中的所有特征指示峰的数量，A为修正系数，0＜A≤1。优选的是，所述药物为可与多药耐药肿瘤细胞上的Mdr1蛋白特异性结合。优选的是，所述药物为维拉帕米、环孢素、阿霉素、长春新碱中的一种或多种。优选的是，所述步骤1)具体包括：以光刻胶为掩膜，用HF酸在载玻片上腐蚀出若干深度与宽度均为10μm的微孔；将具有微孔的载玻片于食人鱼溶液中浸泡，之后取出载玻片用超纯水洗涤并用氮气干燥；将载玻片完全浸润在含有3-氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液中，然后取出载玻片并用纯乙醇洗涤，氮气干燥，制得拉曼增强基底。优选的是，所述步骤2)具体包括：先制备表面采用巯基乙酸修饰，并偶联有药物的金纳米粒子溶液，然后将步骤1)制得的拉曼增强基底浸入该金纳米粒子溶液中，反应过夜后取出拉曼增强基底，清洗干燥。优选的是，所述步骤2)具体包括：先制备表面采用巯基乙酸修饰，并偶联有药物的金纳米粒子溶液；然后将金纳米粒子溶液离心，洗涤后重悬在超纯水中，得到金纳米粒子分散液；然后将步骤1)制得的拉曼增强基底浸入该金纳米粒子分散液中，反应过夜后取出拉曼增强基底，超纯水清洗后用氮气干燥。优选的是，金纳米粒子溶液中，金纳米粒子的直径<10nm。优选的是，所述步骤3)中，先将同一种类肿瘤细胞的多药耐药肿瘤细胞和正常肿瘤细胞分别与金纳米溶液混合，得到的两混合液再分别与步骤2)得到的拉曼增强基底共同孵育。优选的是，所述步骤4)中，先将待检测的肿瘤细胞与金纳米溶液混合，得到的混合液再与步骤2)得到的拉曼增强基底共同孵育。优选的是，所述步骤3)和步骤4)中进行拉曼检测的参数为：激光波长为785nm，最大激发功率为14mW。本专利技术的有益效果是：本专利技术的基于拉曼光谱的多药耐药肿瘤细胞鉴定方法，结合拉曼光谱检测，能在无损的情况下实现对多药耐药肿瘤细胞的快速鉴定，灵敏度高，且能实现液相检测，由于不需要破坏细胞，鉴定出的多药耐药肿瘤细胞能用于后续多药耐药机制研究或个性化药物筛选，本专利技术的方法有望在抗肿瘤药物的开发中获得应用。附图说明图1为本专利技术的实施例中的多药耐药肿瘤细胞与常规肿瘤细胞的拉曼光谱峰；图2为本专利技术的实施例中的细胞的Mdr1蛋白表达检测结果。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。实施例1本实施例提供一种基于拉曼光谱的多药耐药肿瘤细胞鉴定方法，包括以下步骤：1)制备拉曼增强基底；2)在步骤1)得到的拉曼增强基底上偶联可与多药耐药肿瘤细胞特异性结合的药物；3)针对多种类型的肿瘤细胞分别按如下方法获取对应的多药耐药肿瘤细胞的拉曼光谱的特征指示峰，从而构建多种多药耐药肿瘤细胞的拉曼光谱的特征指示峰数据库：将同一种类肿瘤细胞的多药耐药肿瘤细胞和正常肿瘤细胞分别与步骤2)得到的拉曼增强基底共同孵育，然后对与两种肿瘤细胞分别供孵育后的两个拉曼增强基底进行拉曼检测，从而获得多药耐药肿瘤细胞对应的拉曼光谱R1和正常肿瘤细胞对应的拉曼光谱R2，将R1和R2进行比较，获得至少一个在R1中存在而R2中不存在的区别峰，然后从所有区别峰中至少选择一个作为用于指示存在多药耐药肿瘤细胞的特征指示峰T；4)待测肿瘤细胞的鉴定：将待检测的肿瘤细胞与步骤2)得到的拉曼增强基底共同孵育，取出拉曼增强基底后进行拉曼检测，得到待检测的肿瘤细胞的拉曼光谱Rx，根据待检测的肿瘤细胞的种类，在步骤2)获得的拉曼光谱的特征指示峰数据库中获取相同种类的肿瘤细胞所对应的多药耐药肿瘤细胞的所有特征指示峰数据Tn，在Rx中查找出现的包含于Tn中的特征指示峰的数量，记为X；若X≥A*N，则判定待检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于拉曼光谱的多药耐药肿瘤细胞鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)制备拉曼增强基底；/n2)在步骤1)得到的拉曼增强基底上偶联可与多药耐药肿瘤细胞特异性结合的药物；/n3)针对多种类型的肿瘤细胞分别按如下方法获取对应的多药耐药肿瘤细胞的拉曼光谱的特征指示峰，从而构建多种多药耐药肿瘤细胞的拉曼光谱的特征指示峰数据库：/n将同一种类肿瘤细胞的多药耐药肿瘤细胞和正常肿瘤细胞分别与步骤2)得到的拉曼增强基底共同孵育，然后对与两种肿瘤细胞分别供孵育后的两个拉曼增强基底进行拉曼检测，从而获得多药耐药肿瘤细胞对应的拉曼光谱R1和正常肿瘤细胞对应的拉曼光谱R2，将R1和R2进行比较，获得至少一个在R1中存在而R2中不存在的区别峰，然后从所有区别峰中至少选择一个作为用于指示存在多药耐药肿瘤细胞的特征指示峰T；/n4)待测肿瘤细胞的鉴定：将待检测的肿瘤细胞与步骤2)得到的拉曼增强基底共同孵育，取出拉曼增强基底后进行拉曼检测，得到待检测的肿瘤细胞的拉曼光谱Rx，根据待检测的肿瘤细胞的种类，在步骤2)获得的拉曼光谱的特征指示峰数据库中获取相同种类的肿瘤细胞所对应的多药耐药肿瘤细胞的所有特征指示峰数据Tn，在Rx中查找出现的包含于Tn中的特征指示峰的数量，记为X；若X≥A*N，则判定待检测的肿瘤细胞为多药耐药肿瘤细胞，否则为正常肿瘤细胞，其中，N表示Tn中的所有特征指示峰的数量，A为修正系数，0＜A≤1。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于拉曼光谱的多药耐药肿瘤细胞鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备拉曼增强基底；
2)在步骤1)得到的拉曼增强基底上偶联可与多药耐药肿瘤细胞特异性结合的药物；
3)针对多种类型的肿瘤细胞分别按如下方法获取对应的多药耐药肿瘤细胞的拉曼光谱的特征指示峰，从而构建多种多药耐药肿瘤细胞的拉曼光谱的特征指示峰数据库：
将同一种类肿瘤细胞的多药耐药肿瘤细胞和正常肿瘤细胞分别与步骤2)得到的拉曼增强基底共同孵育，然后对与两种肿瘤细胞分别供孵育后的两个拉曼增强基底进行拉曼检测，从而获得多药耐药肿瘤细胞对应的拉曼光谱R1和正常肿瘤细胞对应的拉曼光谱R2，将R1和R2进行比较，获得至少一个在R1中存在而R2中不存在的区别峰，然后从所有区别峰中至少选择一个作为用于指示存在多药耐药肿瘤细胞的特征指示峰T；
4)待测肿瘤细胞的鉴定：将待检测的肿瘤细胞与步骤2)得到的拉曼增强基底共同孵育，取出拉曼增强基底后进行拉曼检测，得到待检测的肿瘤细胞的拉曼光谱Rx，根据待检测的肿瘤细胞的种类，在步骤2)获得的拉曼光谱的特征指示峰数据库中获取相同种类的肿瘤细胞所对应的多药耐药肿瘤细胞的所有特征指示峰数据Tn，在Rx中查找出现的包含于Tn中的特征指示峰的数量，记为X；若X≥A*N，则判定待检测的肿瘤细胞为多药耐药肿瘤细胞，否则为正常肿瘤细胞，其中，N表示Tn中的所有特征指示峰的数量，A为修正系数，0＜A≤1。


2.根据权利要求1所述的基于拉曼光谱的多药耐药肿瘤细胞鉴定方法，其特征在于，所述药物为可与多药耐药肿瘤细胞上的Mdr1蛋白特异性结合。


3.根据权利要求2所述的基于拉曼光谱的多药耐药肿瘤细胞鉴定方法，其特征在于，所述药物为维拉帕米、环孢素、阿霉素、长春新碱中的一种或多种。


4.根据权利要求1所述的基于拉曼光谱的多药耐药肿瘤细胞鉴定方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：以光刻胶为掩膜，...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷建，尹焕才，张志强，陈名利，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，济南国科医工科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32