一种微流控芯片及其应用制造技术

本发明专利技术涉及单细胞抗体检测与扩增技术领域。具体涉及一种微流控芯片及其应用。本发明专利技术的芯片由依次叠放在一起并相互密封的微阀控制层，微阀薄膜层，细胞处理层和基底层组成；具有液体注入口、细胞悬液入口、细胞悬液出口、扩增产物收集出口、微阀进气口、微阀进气口、扩增产物释放微阀控制结构和液体流动微阀控制结构；扩增产物释放微阀控制结构通过气体流道上的微阀控制扩增产物的释放，液体流动微阀控制结构通过气体流道上的微阀控制控制细胞处理层中液体的流动，细胞处理结构包括多个细胞处理单元，每个细胞处理单元包括液体流道和一个基因扩增腔室；细胞的捕获、鉴别和扩增在其中完成。本发明专利技术所有功能集成在同一芯片上，操作快速、简便。

【技术实现步骤摘要】
一种微流控芯片及其应用
本专利技术涉及单细胞抗体检测与扩增
具体地说，涉及一种微流控芯片及其应用。
技术介绍
单克隆抗体成为肿瘤治疗、抵抗病毒和疾病诊断的有效方法之一，尤其在免疫治疗领域发挥了重要的作用。抗体分子由2条相同的重链和2条相同的轻链组成，相同链间、不同链间通过二硫键相连接形成Y字型结构。重链和轻链的N端110个左右氨基酸高度可变，称为可变区，具有特异性结合抗原的功能，因此获取抗体可变区的基因序列是抗体研制的关键步骤。抗体研制的平台有杂交瘤技术、噬菌体展示技术和单个B细胞技术。杂交瘤技术是经典的方法，由抗原免疫的正常小鼠/人源化小鼠细胞的B细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，采用ELISA、免疫荧光、流式细胞术等检测抗体的特异性、亲和力等性质。杂交瘤技术筛选方法低通量、耗时、耗力，需要较长的筛选周期才能得到目标抗体。噬菌体展示技术将所有阳性抗体的细胞重链和轻链cDNA克隆至噬菌体载体中，表达于细胞的表面进行多轮淘洗，获取强亲和力的抗体，对表达强亲和力的细胞培养、基因扩增得到抗体的轻重链序列。但上述方法是基于细胞群体分析，收集不同细胞分泌的抗体，或混合筛选抗体，无法排除非特异性抗体的干扰，不能精确反映每个细胞分泌的抗体的特异性。近年来，基于单细胞分析的方法成为抗体发现的重要发展领域，如流式细胞术、微流控芯片等方法；其中，流式细胞术是基于荧光染色的方法，将荧光标记的抗原与B细胞混合孵育，分泌特异性抗体的细胞被染上荧光，从而被分选至96/384孔板内，进行单细胞的RT-PCR。该方法具有高通量的优势，但仅能检测细胞膜上的抗体，而分泌型的抗体几乎无法检测其抗体特异性，只能筛选表达特定标志物的细胞。微流控芯片技术是通过微纳加工的方法，制作与细胞大小尺寸相对应的几何结构腔室、物理屏障来捕获单个细胞，每个腔室的体积仅纳升/皮升水平。微流控芯片技术有微液滴和微阵列方法，微液滴方法可将单个细胞与荧光探针包裹于油包水的液滴内，把细胞分泌的抗体收集于纳升/皮升的液滴内，由此检测到单细胞分泌出的抗体。同时，也可以将单个细胞与细胞裂解液、RT-PCR反应液包裹在一起形成液滴，实现抗体基因的扩增。上述两种功能：抗体检测、基因扩增需要2次液滴生成的过程，操作要求高、而且液滴是封闭的腔室、无法进行游离荧光探针的清洗去除，从而增加背景信号的干扰、降低信噪比，造成假阴性。相对于液滴，微阵列芯片是开放的环境，微结构完成细胞的捕获与固定、可以实现溶液的交换、液体的连续流动进样，对游离荧光探针的去除，有效避免假阴性的出现。但现有微流控芯片功能单一，仅能完成抗体检测、基因扩增中的一个步骤。少量细胞在不同芯片间的转移，容易造成细胞的丢失、扩增的污染，导致实验的失败。所以，有必要针对单细胞的抗体检测和基因扩增应用设计全新的微流控芯片。
技术实现思路
针对现有技术的问题，本专利技术的目的是提供一种可在同一芯片中实现对单细胞的捕获、抗体鉴定和基因扩增的微流控芯片，以达到筛选高分泌抗体的细胞并扩增抗体基因的目的。为了实现该目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供一种微流控芯片，其由依次叠放在一起并相互密封的四层结构组成，所述四层结构由上至下分别为微阀控制层1，微阀薄膜层2，细胞处理层3和基底层4；所述微阀控制层1上设有第一液体注入口101、多个第一细胞悬液入口102-109、多个第一细胞悬液出口110-113、多个第一扩增产物收集出口114-117、多个第一微阀进气口118-129、多个第二微阀进气口130-137、扩增产物释放微阀控制结构和液体流动微阀控制结构；所述扩增产物释放微阀控制结构由多条独立控制的气体流道组成，与微阀薄膜层共同控制扩增产物的释放；每个第一微阀进气口对应连通一条气体流道，用于控制气体流道内的压力，每条气体流道上包括多个扩增产物释放微阀；所述液体流动微阀控制结构包括第一气体流道、第二气体流道和第三气体流道；所述第一气体流道上包括多个基因扩增腔室控制微阀D；所述第二气体流道上包括一个主流道起始控制微阀A、多个支流道控制微阀B和多个细胞处理单元间控制微阀C；所述第三气体流道上包括多个反应液流道控制微阀E；多个所述第二微阀进气口130-137用于控制液体流动微阀控制结构中的各气体流道内的压力；所述第一气体流道和第三气体流道内的压力由同一个所述第二微阀进气口控制，所述第二气体流道内的压力由另一个所述第二微阀进气口控制；所述微阀薄膜层2上设有第二液体注入口、多个第二细胞悬液入口、多个第二细胞悬液出口和多个第二扩增产物收集出口；所述细胞处理层3上设有第三液体注入口301，多个第三细胞悬液入口302-309、多个第三细胞悬液出口310-313、多个第三扩增产物收集出口314-317和细胞处理结构；所述细胞处理结构包括多个细胞处理单元，每个细胞处理单元包括液体流道和一个基因扩增腔室；所述液体流道包括主流道、支流道和反应液流道；多个所述细胞处理单元通过主流道和反应液流道进行串联；第一个细胞处理单元的主流道上包括一个主流道起始微阀控制区A’、一个流道狭窄区域和一个细胞处理单元间微阀控制区C’；所述主流道和所述支流道的直径大于待捕获的单个细胞，所述流道狭窄区域的直径小于所述单个细胞，在适当的流速下，单个细胞可被拦截在流道狭窄区域。具体各流道直径可根据单个细胞尺寸进行调整。第一个细胞处理单元的支流道包括连通流道、腔室进入流道和反应液连通流道；所述第一个细胞处理单元位于串联的多个所述细胞处理单元的起始位置；所述连通流道将所述流道狭窄区域的两侧进行连通，并包括一个支流道微阀控制区B’；所述腔室进入流道将所述连通流道与所述基因扩增腔室连通，并包括一个基因扩增腔室微阀控制区D’；所述支流道微阀控制区B’位于连通所述基因扩增腔室微阀控制区D’和所述流道狭窄区域远离主流道内液体流入方向一侧的连通流道上；所述反应液连通流道将所述主流道与所述反应液流道连通，并包括一个反应液流道微阀控制区E’；所述反应液连通流道与所述主流道连接的位置位于所述流道狭窄区域远离主流道内液体流入方向的一侧；其余细胞处理单元的结构与第一个细胞处理单元相同，区别仅在于其余细胞处理单元的主流道上不包括所述主流道起始微阀控制区A’；所述主流道起始控制微阀A对应控制所述主流道起始微阀控制区A’，从而控制主流道整体的连通或封闭；每个所述支流道控制微阀B对应控制一个所述支流道微阀控制区B’，从而控制连通流道的连通或封闭；每个所述细胞处理单元间控制微阀C对应控制一个所述细胞处理单元间微阀控制区C’，从而控制细胞处理单元间在主流道上的连通或封闭；每个所述基因扩增腔室控制微阀D对应控制一个所述基因扩增腔室微阀控制区D’，从而控制腔室进入流道的连通或封闭；每个所述反应液流道控制微阀E对应控制一个所述反应液流道微阀控制区E’，从而控制反应液连通流道的连通或封闭；所述扩增产物释放微阀用于控制每一个基因扩增腔室的产物释放；所述第一液体注入口101、第二液体注入口和第三液体注入口本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片由依次叠放在一起并相互密封的四层结构组成，所述四层结构由上至下分别为微阀控制层，微阀薄膜层，细胞处理层和基底层；/n所述微阀控制层上设有第一液体注入口、多个第一细胞悬液入口、多个第一细胞悬液出口、多个第一扩增产物收集出口、多个第一微阀进气口、多个第二微阀进气口、扩增产物释放微阀控制结构和液体流动微阀控制结构；/n所述扩增产物释放微阀控制结构由多条独立控制的气体流道组成，与微阀薄膜层共同控制扩增产物的释放；每个第一微阀进气口对应连通一条气体流道，用于控制气体流道内的压力，每条气体流道上包括多个扩增产物释放微阀；/n所述液体流动微阀控制结构包括第一气体流道、第二气体流道和第三气体流道；所述第一气体流道上包括多个基因扩增腔室控制微阀D；所述第二气体流道上包括一个主流道起始控制微阀A、多个支流道控制微阀B和多个细胞处理单元间控制微阀C；所述第三气体流道上包括多个反应液流道控制微阀E；多个所述第二微阀进气口用于控制所述液体流动微阀控制结构中的各气体流道内的压力；所述第一气体流道和第三气体流道内的压力由同一个所述第二微阀进气口控制，所述第二气体流道内的压力由另一个所述第二微阀进气口控制；/n所述微阀薄膜层上设有第二液体注入口、多个第二细胞悬液入口、多个第二细胞悬液出口和多个第二扩增产物收集出口；/n所述细胞处理层上设有第三液体注入口，多个第三细胞悬液入口、多个第三细胞悬液出口、多个第三扩增产物收集出口和细胞处理结构；所述细胞处理结构包括多个细胞处理单元，每个细胞处理单元包括液体流道和一个基因扩增腔室；所述液体流道包括主流道、支流道和反应液流道；多个所述细胞处理单元通过主流道和反应液流道进行串联；/n第一个细胞处理单元的主流道上包括一个主流道起始微阀控制区A’、一个流道狭窄区域和一个细胞处理单元间微阀控制区C’；/n所述主流道和所述支流道的直径大于待捕获的单个细胞，所述流道狭窄区域的直径小于所述单个细胞；/n第一个细胞处理单元的支流道包括连通流道、腔室进入流道和反应液连通流道；所述第一个细胞处理单元位于串联的多个所述细胞处理单元的起始位置；/n所述连通流道将所述流道狭窄区域的两侧进行连通，并包括一个支流道微阀控制区B’；/n所述腔室进入流道将所述连通流道与所述基因扩增腔室连通，并包括一个基因扩增腔室微阀控制区D’；所述支流道微阀控制区B’位于连通所述基因扩增腔室微阀控制区D’和所述流道狭窄区域远离主流道内液体流入方向一侧的连通流道上；/n所述反应液连通流道将所述主流道与所述反应液流道连通，并包括一个反应液流道微阀控制区E’；所述反应液连通流道与所述主流道连接的位置位于所述流道狭窄区域远离主流道内液体流入方向的一侧；/n其余细胞处理单元的结构与第一个细胞处理单元相同，区别仅在于其余细胞处理单元的主流道上不包括所述主流道起始微阀控制区A’；/n所述主流道起始控制微阀A对应控制所述主流道起始微阀控制区A’，从而控制主流道整体的连通或封闭；每个所述支流道控制微阀B对应控制一个所述支流道微阀控制区B’，从而控制连通流道的连通或封闭；每个所述细胞处理单元间控制微阀C对应控制一个所述细胞处理单元间微阀控制区C’，从而控制细胞处理单元间在主流道上的连通或封闭；每个所述基因扩增腔室控制微阀D对应控制一个所述基因扩增腔室微阀控制区D’，从而控制腔室进入流道的连通或封闭；每个所述反应液流道控制微阀E对应控制一个所述反应液流道微阀控制区E’，从而控制反应液连通流道的连通或封闭；所述扩增产物释放微阀用于控制每一个基因扩增腔室的产物释放；/n所述第一液体注入口、所述第二液体注入口和所述第三液体注入口相互对应连通，用于使液体流入整个微流控芯片区域；/n多个所述第一细胞悬液入口、多个所述第二细胞悬液入口和多个所述第三细胞悬液入口相互对应连通，用于使液体进入各液体流道中；/n多个所述第一细胞悬液出口、多个所述第二细胞悬液出口和多个所述第三细胞悬液出口相互对应连通，用于使各液体流道的液体流出微流控芯片；/n多个所述第一扩增产物收集出口、多个所述第二扩增产物收集出口和多个所述第三扩增产物收集出口相互对应连通，用于使各基因扩增腔室的扩增产物流出微流控芯片。/n...

【技术特征摘要】
1.一种微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片由依次叠放在一起并相互密封的四层结构组成，所述四层结构由上至下分别为微阀控制层，微阀薄膜层，细胞处理层和基底层；
所述微阀控制层上设有第一液体注入口、多个第一细胞悬液入口、多个第一细胞悬液出口、多个第一扩增产物收集出口、多个第一微阀进气口、多个第二微阀进气口、扩增产物释放微阀控制结构和液体流动微阀控制结构；
所述扩增产物释放微阀控制结构由多条独立控制的气体流道组成，与微阀薄膜层共同控制扩增产物的释放；每个第一微阀进气口对应连通一条气体流道，用于控制气体流道内的压力，每条气体流道上包括多个扩增产物释放微阀；
所述液体流动微阀控制结构包括第一气体流道、第二气体流道和第三气体流道；所述第一气体流道上包括多个基因扩增腔室控制微阀D；所述第二气体流道上包括一个主流道起始控制微阀A、多个支流道控制微阀B和多个细胞处理单元间控制微阀C；所述第三气体流道上包括多个反应液流道控制微阀E；多个所述第二微阀进气口用于控制所述液体流动微阀控制结构中的各气体流道内的压力；所述第一气体流道和第三气体流道内的压力由同一个所述第二微阀进气口控制，所述第二气体流道内的压力由另一个所述第二微阀进气口控制；
所述微阀薄膜层上设有第二液体注入口、多个第二细胞悬液入口、多个第二细胞悬液出口和多个第二扩增产物收集出口；
所述细胞处理层上设有第三液体注入口，多个第三细胞悬液入口、多个第三细胞悬液出口、多个第三扩增产物收集出口和细胞处理结构；所述细胞处理结构包括多个细胞处理单元，每个细胞处理单元包括液体流道和一个基因扩增腔室；所述液体流道包括主流道、支流道和反应液流道；多个所述细胞处理单元通过主流道和反应液流道进行串联；
第一个细胞处理单元的主流道上包括一个主流道起始微阀控制区A’、一个流道狭窄区域和一个细胞处理单元间微阀控制区C’；
所述主流道和所述支流道的直径大于待捕获的单个细胞，所述流道狭窄区域的直径小于所述单个细胞；
第一个细胞处理单元的支流道包括连通流道、腔室进入流道和反应液连通流道；所述第一个细胞处理单元位于串联的多个所述细胞处理单元的起始位置；
所述连通流道将所述流道狭窄区域的两侧进行连通，并包括一个支流道微阀控制区B’；
所述腔室进入流道将所述连通流道与所述基因扩增腔室连通，并包括一个基因扩增腔室微阀控制区D’；所述支流道微阀控制区B’位于连通所述基因扩增腔室微阀控制区D’和所述流道狭窄区域远离主流道内液体流入方向一侧的连通流道上；
所述反应液连通流道将所述主流道与所述反应液流道连通，并包括一个反应液流道微阀控制区E’；所述反应液连通流道与所述主流道连接的位置位于所述流道狭窄区域远离主流道内液体流入方向的一侧；
其余细胞处理单元的结构与第一个细胞处理单元相同，区别仅在于其余细胞处理单元的主流道上不包括所述主流道起始微阀控制区A’；
所述主流道起始控制微阀A对应控制所述主流道起始微阀控制区A’，从而控制主流道整体的连通或封闭；每个所述支流道控制微阀B对应控制一个所述支流道微阀控制区B’，从而控制连通流道的连通或封闭；每个所述细胞处理单元间控制微阀C对应控制一个所述细胞处理单元间微阀控制区C’，从而控制细胞处理单元间在主流道上的连通或封闭；每个所述基因扩增腔室控制微阀D对应控制一个所述基因扩增腔室微阀控制区D’，从而控制腔室进入流道的连通或封闭；每个所述反应液流道控制微阀E对应控制一个所述反应液流道微阀控制区E’，从而控制反应液连通流道的连通或封闭；所述扩增产物释放微阀用于控制每一个基因扩增腔室的产物释放；
所述第一液体注入口、所述第二液体注入口和所述第三液体注入口相互对应连通，用于使液体流入整个微流控芯片...

【专利技术属性】
技术研发人员：李勤，魏泽文，张卫凯，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11