棕色脂肪细胞来源的外泌体的应用制造技术

本发明专利技术公开了棕色脂肪细胞来源的外泌体的应用。棕色脂肪细胞来源的外泌体在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用，优选在制备治疗高脂肥胖引起的非酒精性脂肪肝的药物中的应用。所述的棕色脂肪细胞来源的外泌体表达标志性蛋白CD63、CD9和TSG101。所提取的棕色脂肪细胞来源的外泌体能够有效减轻高脂诱导的肥胖小鼠的非酒精性脂肪肝的重量，肝脏与体积的比值，减轻肝脏中脂肪酸和胆固醇的含量，减小了肝脏，使肝脏中的脂肪合成减缓同时增加了脂肪酸的消耗。这为治疗高脂引起的肥胖小鼠的非酒精性脂肪肝提供了新的途经。

【技术实现步骤摘要】
棕色脂肪细胞来源的外泌体的应用
本专利技术涉及棕色脂肪细胞来源的外泌体的应用，具体是棕色脂肪细胞产生的外泌体在肥胖引起的非酒精性脂肪肝治疗中的应用。
技术介绍
非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一种常见的肝脏疾病，其定义为在未饮酒或者少量饮酒的情况下在肝脏中5％以上的肝细胞发生了脂肪堆积。据不完全统计，全球14％到27％的人患有脂肪肝。目前对于脂肪肝的药物治疗并不能满足临床需求，并且到目前为止，并没有FDA批准的用于治疗较为严重的非酒精性脂肪肝的药物。棕色脂肪组织是一种产能组织，其能够通过线粒体中的解偶联蛋白UCP1，从而将体内储存的化学能转化为热能来维持体温，即产生非震颤性产热来维持体温。同时伴随着棕色脂肪组织在成人中的重新发现，同时有研究表明在人体中棕色脂肪的存在与肥胖和糖尿病是负相关的，因此将激活棕色脂肪组织作为一种治疗代谢类疾病的方式得到了越来越多的关注。并且近年来的研究表明移植棕色脂肪组织不仅能够改善高脂诱导的肥胖小鼠的胰岛素抵抗，并且也能在不影响进食的情况下降低天生的肥胖小鼠ob/ob(瘦素缺失小鼠)的葡萄糖稳态。然而由于在人体中，棕色脂肪组织与白色脂肪组织呈一个混合的存在状态，其主要存在于肩胛骨、肾周和脊柱附近，而且并不像啮齿类动物一样具有明显的可区分的组织块，同时移植的脂肪组织的存活率较低，所以通过移植棕色脂肪组织来治疗脂肪肝和其他代谢类疾病在人体中具有很大的技术难度。同时利用寒冷等刺激方式激活人体棕色脂肪组织进行产热消耗能量的方式来进行治疗也具有很大程度的局限性，因为一些肥胖人体中并不存在或者只有很少量棕色脂肪，所以其消耗能量的能力有限。近年来的研究表明，棕色脂肪组织除了是一种重要的产热器官外，其还是一种重要的内分泌器官，能过分泌多种的棕色脂肪因子来调节全身的代谢稳态。其中外泌体(exosome)作为一种重要的细胞间交流工具得到了越来越多的关注。外泌体携带了大量的核酸(miRNA，lncRNA，mRNA)、蛋白质和脂质到达目的细胞进行调节，同时其直径大小符合纳米材料的大小，具有较强的递送信息的能力，同时由于外泌体是内源性的，并不会引起身体的免疫反应。但目前尚未见到棕色脂肪细胞来源的外泌体治疗脂肪肝的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供棕色脂肪细胞来源的外泌体在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：棕色脂肪细胞来源的外泌体在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。作为本专利技术的一种优选，棕色脂肪细胞来源的外泌体在制备治疗高脂肥胖引起的非酒精性脂肪肝的药物中的应用。所述的棕色脂肪细胞来源的外泌体表达标志性蛋白CD63、CD9和TSG101。粒镜和电镜结果表明其平均直径在100nm左右，同时电镜结果表明其具有脂双层结构符合外泌体的特征。本专利技术首次通过动物实验证明：棕色脂肪细胞分泌的外泌体能够有效改善高脂引起的肥胖小鼠的非酒精性脂肪肝，包括减少肝的重量，肝与体重的比值，肝脏切片中脂滴含量下降，脂滴大小减小，肝脏中甘油三酯和总胆固醇的含量下降，同时肝脏中脂肪酸合成相关基因的表达量下降，脂肪酸β氧化相关基因的表达量上升。本专利技术的有益效果是：1.所提取的棕色脂肪细胞来源的外泌体能够有效减轻高脂诱导的肥胖小鼠的非酒精性脂肪肝的重量，肝脏与体积的比值，减轻肝脏中脂肪酸和胆固醇的含量，减小了肝脏，使肝脏中的脂肪合成减缓同时增加了脂肪酸的消耗。这为治疗高脂引起的肥胖小鼠的非酒精性脂肪肝提供了新的途经。2.外泌体作为一种内源性的细胞外囊泡，其直径大小与纳米级载体相似。并且exosome能够携带不同的信号分子(RNA和蛋白)，因此其具有潜在的作为药物递送载体的能力。并且相对于外源性的纳米载体，外泌体具有不引起免疫反应并且不具有生物学毒性等优势。本专利技术经过一定方法提取的外泌体，可以在-80度冰箱中长期保存。附图说明：图1Western-blot法检测棕色脂肪细胞来源外泌体的标志蛋白CD63、CD9和TSG101。图2电镜观察外泌体的形态：标尺为100nm。图3粒镜检测外泌体的直径分布。图4外泌体治疗非酒精性脂肪肝的计划示意图。图5治疗前后小鼠体重变化。图6治疗组与非治疗组肝脏的重量及肝脏重量与体重的比值。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001图7治疗组和非治疗组高脂小鼠肝脏的病理改变：H&E染色切片图，标尺为100μm。图8治疗组和非治疗组高脂小鼠肝脏中脂滴的含量：油红染色图，标尺为100μm。图9治疗组和非治疗组高脂小鼠肝脏中甘油三酯的含量的变化。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001图10治疗组和非治疗组高脂小鼠肝脏中总胆固醇含量的变化。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001图11治疗组和非治疗组高脂小鼠肝脏中胆固醇合成，流出，脂肪酸吸收，合成和β氧化相关基因表达量的变化。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001具体实施例：实施例1分离培养棕色脂肪细胞分泌的外泌体。(1)棕色脂肪细胞外泌体的提取将鼠断颈处死后，从小鼠肩胛骨部位取出棕色脂肪细胞，去除棕色脂肪上方少量的白色脂肪。用剪刀将棕色脂肪细胞剪碎。剪碎后置于含有10％mvfreeFBS的DMEM(均购于Gibco公司)培液中，后置于二氧化碳恒温箱中进行培养。培养24小时后，收取培液进行exosome的提取。(2)外泌体的提取首先对培液进行预处理，预处理的方法为300xg，离心10分钟，除去沉淀后3000xg，离心30分钟，再除去沉底，最后10000xg，离心60分钟，然后除去沉淀。预处理是为了去除培液中的细胞碎片或者一些较大的囊泡，如凋亡小体，MV等。最后对预处理之后的培液进行120000xg的超速离心，离心时间为3小时。离心结束后，将培液缓慢倾倒掉，之后用60ul的PBS对离在管底的exosome进行重悬，用于后续实验。实施例2棕色脂肪细胞来源外泌体的鉴定(1)Western-blot鉴定外泌体标志蛋白CD63、CD9和TSG101加入适量的细胞裂解液。将细胞裂解液(购于碧云天)置于冰上裂解30分钟，使细胞裂解液充分作用。对细胞裂解液中的细胞进行超声破碎，使细胞中的蛋白释放更完全。4℃，12000xg，离心5分钟。吸取上清，进行蛋白浓度测试。蛋白浓度测试的方法为BCA法(购于赛默飞公司)，将蛋白稀释10倍后进行测量，即在9μlddH2O中加入1μl蛋白液(详细的步骤见相关的说明书)。将蛋白调到同一的浓度，加入5xloadingbuffer(购于碧云天)，然后在100℃金属浴中煮5分钟，后将煮好的蛋白放于-20℃保存。配置SDS-PAGE胶(相关试剂购于碧云天)，缓慢上蛋白样后，在浓缩胶阶段使用70V恒压进行电泳，等蛋白进入分离胶后，增加电压到110V恒压跑。根据本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.棕色脂肪细胞来源的外泌体在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.棕色脂肪细胞来源的外泌体在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于棕色脂肪细胞来源的外泌体在制备治疗高脂肥胖...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑莎莎，方祝元，
申请(专利权)人：江苏省中医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32