一种检测克罗诺杆菌的纸基检测装置及其应用制造方法及图纸

一种检测克罗诺杆菌的纸基检测装置及其应用，属于食品安全技术领域。为了解决利用传统微生物学方法以及分子生物学方法检测克罗诺杆菌中存在的问题，本发明专利技术提供了一种纸基检测装置，所述纸基检测装置的检测原理为克罗诺杆菌经超声破碎处理可产生胞内酶α‑葡萄糖苷酶，可在经底物XαGlc修饰的纸基检测装置上发生特异性酶‑底物反应，进而能够在纸基装置上快速、直观对克罗诺杆菌进行定性与定量。本发明专利技术获得的纸基检测装置具有制作方法简单、成本低以及装置灵敏度高等特点，可用于实时检测食品及食品加工过程中的克罗诺杆菌污染，尤其是婴幼儿配方奶粉生产中的克罗诺杆菌污染。

【技术实现步骤摘要】
一种检测克罗诺杆菌的纸基检测装置及其应用
本专利技术涉及一种检测克罗诺杆菌的纸基检测装置及其应用，属于食品安全

技术介绍
近年来，随着一系列涉及食源性致病菌的奶粉召回和重大感染事件的爆发，克罗诺杆菌的污染问题引起了全世界的关注。克罗诺杆菌能够污染婴幼儿配方乳粉(PIF)引起新生儿严重的菌血症、坏死性小肠结肠炎以及脑膜炎等疾病，与其他食源性致病菌相比，该菌感染率不高，但对于特殊人群有高达40％—80％致死率。因此预防和检测克罗诺杆菌至关重要。克罗诺杆菌隶属于肠杆菌科，为能运动、周生鞭毛、兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌为条件性致病菌，对营养要求不高，基础的肉汤培养基即可满足生长繁殖的需要。克罗诺杆菌属的α-葡萄糖苷酶是区别于肠杆菌科其他菌属的一个重要特征，可分解5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃葡萄糖苷特异性酶底物，呈现蓝绿色易于辨别。目前，对克罗诺杆菌的检测方法主要有传统微生物学法以及新兴分子生物学法，如聚合酶链式扩增反应(PCR)和等温扩增技术等。传统的微生物学方法耗时长且检测效率低，无法满足对于致病菌快速、方便、高通量以及高灵敏度检测的要求，因此迫切需要一种操作简单、快速的检测技术。新兴的分子技术由于扩增的核酸可能来自死亡细胞，可能会造成结果不准确等问题。其中一些检测方法还存在着仪器昂贵，需要专业技术人员操作等问题。大多数基于开发克罗诺杆菌特异性免疫传感器的研究都是使用自己研制的抗体，但制备过程非常复杂和困难，目前还没有针对这种细菌的商业抗体。因此，迫切需要一种更简单、经济、快速检测的活菌检测分析系统。微流体纸基分析装置由于其价格便宜、便携、易于检测等优点为发展中国家或资源匮乏地区提供了一种很好的替代技术，将会是未来快速检测小型化、便携化的必然趋势。目前对于在纸基装置上对细菌的特异性检测研究较少，还没有利用该原理在纸基上检测克罗诺杆菌的报道。
技术实现思路
为了解决利用传统微生物学方法以及分子生物学方法检测克罗诺杆菌中存在的问题，本专利技术提供了一种更简单、经济、快速地检测克罗诺杆菌的纸基检测装置，所述纸基检测装置以WhatmanNo.1滤纸作为纸基材料，通过PVC胶板处理及5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷溶液的修饰获得。在本专利技术的一个实施例中，所述PVC胶板处理WhatmanNo.1滤纸的方法为：S1、将PVC胶板切割成若干个边长为1cm×1cm的方形底板；S2、将WhatmanNo.1滤纸用圆形打孔器进行打孔，打孔下来的圆形滤纸留存备用；S3、用同样孔径尺寸的圆形打孔器在切割后的底板区域中心进行手动打孔；S4、将一张同样形状大小的未打孔的PVC胶板作为底板，揭去底板和S3获得的打过孔的PVC胶板涂有黏胶的一侧保护薄膜，压紧对贴粘合，把S2获得的同孔径的滤纸放置在暴露的带有黏胶的孔中，用力压制使三者充分粘合，装置制作完成。进一步地限定，所述打孔器的孔径为4mm-8mm。在本专利技术的一个实施例中，所述5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷溶液的修饰方法为：将柠檬酸-磷酸盐缓冲液与DMF按照1:1的体积比混合，用于稀释5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷溶液，再向经PVC胶板处理后的滤纸上滴加10μL稀释后的5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷溶液，干燥后完成修饰过程。进一步地限定，所述稀释后的5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷溶液浓度为0.5mM～10mM。进一步地限定，所述柠檬酸-磷酸盐缓冲液中柠檬酸溶液浓度为0.1M，磷酸氢二钠溶液浓度为0.2M。进一步地限定，所述纸基检测装置的承载温度为-20℃～80℃，加样量为8μL～20μL。本专利技术还提供了利用所述的纸基检测装置检测克罗诺杆菌的方法，具体步骤如下：步骤一、将克罗诺杆菌菌液离心后，用柠檬酸-磷酸缓冲液将菌体沉淀洗涤2～3次，然后加入与原菌液相同体积的柠檬酸-磷酸缓缓冲液重悬菌体；步骤二、将重悬后的菌体进行超声，每超声10s，暂停15s为一个循环，共循环3～5次，超声参数为130W，22kHz，全程进行冰水浴；步骤三、取8μL～20μL步骤二获得的上清液滴入纸基检测装置的加样孔，等待显色。进一步地限定，步骤一中的柠檬酸-磷酸缓冲液的pH为6.0～7.5；步骤三所述显色反应在37℃条件下进行。本专利技术还提供了所述的纸基检测装置在实时检测食品及食品加工过程中克罗诺杆菌污染中的应用。有益效果本专利技术的原理在于，克罗诺杆菌经超声破碎处理可产生胞内酶α-葡萄糖苷酶，可与纸基检测装置修饰的底物XαGlc发生特异性酶-底物反应。1)本专利技术首次构建针对克罗诺杆菌的纸基检测装置，制作方法简单、成本低以及装置精密度高，为检测克罗诺杆菌提供新思路，为纸芯片检测技术在致病菌检测中的应用提供理论基础。同时，本专利技术具有灵敏、快速以及准确等优点，在乳制品生产以及乳制品安全保障方面具有重要意义。2)本专利技术利用酶与底物特异性反应的原理实现对克罗诺杆菌的特异性检出，避免了假阳性的产生，同时，纸基材料的应用大大降低了该检测装置的成本，避免其他检测方式重复利用带来的交叉污染等影响。3)利用本专利技术建立的方法可用于实时检测食品及食品加工过程中克罗诺杆菌，尤其是对婴幼儿配方奶粉生产中的克罗诺杆菌污染。附图说明图1.纸基检测装置PVC处理方法示意图；图2.蜡笔、马克笔以及PVC胶板三种不同处理方式下的纸基检测装置的重现性与精密度的比较结果；图3.纸基检测装置底物修饰浓度的检测结果；图4.超声破碎时间对检测效果的影响；图5.显色反应温度对检测效果的影响；图6.显色反应干燥时间对检测效果的影响；图7.反应pH对检测效果的影响；图8.纸基检测装置灵敏度考察结果；图9.纸基检测装置重现性考察结果；图10.纸基检测装置稳定性考察结果；图11.纸基检测装置实用性考察结果。具体实施方式下面结合具体实施例及附图对本专利技术做出进一步说明，但本专利技术不受实施例的限制。以下实施例所用的材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域常规的材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得，所用各种菌株均来源于东北农业大学乳品重点实验室。实施例一、纸基检测装置的制备方法(1)纸基处理方式的选择以WhatmanNo.1滤纸为纸基材料，分别比较蜡笔、马克笔以及PVC胶板三种不同处理方式下的纸基检测装置的重现性与精密度。1.蜡笔处理利用灰色蜡笔在WhatmanNo.1滤纸沿着圆形部件进行外围的图案绘制，手绘图案后进行加热处理，使其完全浸透滤纸，形成疏水区域。加热条件为：加热温度120℃，加热时间5min。干燥后对装置进行图像扫描与分析。2.马克笔利用办公常用的油性笔(马克笔)在滤纸上进行图案的绘制，同样沿着已画好的圆形曲线进行临摹，再将滤纸翻本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测克罗诺杆菌的纸基检测装置，其特征在于，所述纸基检测装置以WhatmanNo.1滤纸作为纸基材料，通过PVC胶板处理及5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷溶液的修饰获得。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测克罗诺杆菌的纸基检测装置，其特征在于，所述纸基检测装置以WhatmanNo.1滤纸作为纸基材料，通过PVC胶板处理及5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷溶液的修饰获得。


2.根据权利要求1所述的纸基检测装置，其特征在于，所述PVC胶板处理WhatmanNo.1滤纸的方法为：
S1、将PVC胶板切割成若干个边长为1cm×1cm的方形底板；
S2、将WhatmanNo.1滤纸用圆形打孔器进行打孔，打孔下来的圆形滤纸留存备用；
S3、用同样孔径尺寸的圆形打孔器在切割后的底板区域中心进行手动打孔；
S4、将一张同样形状大小的未打孔的PVC胶板作为底板，揭去底板和S3获得的打过孔的PVC胶板涂有黏胶的一侧保护薄膜，压紧对贴粘合，把S2获得的同孔径的滤纸放置在暴露的带有黏胶的孔中，用力压制使三者充分粘合，装置制作完成。


3.根据权利要求2所述的纸基检测装置，其特征在于，所述打孔器的孔径为4mm-8mm。


4.根据权利要求1所述的纸基检测装置，其特征在于，所述5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷溶液的修饰方法为：将柠檬酸-磷酸盐缓冲液与DMF按照1:1的体积比混合，用于稀释5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷溶液，再向经PVC胶板处理后的滤纸上滴加10μL稀释后的5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜毓君，秦雪，满朝新，苗超，王莉涵，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23