一种新型萤火虫萤光素酶突变体、其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种新型萤火虫萤光素酶突变体、其制备方法和应用。萤火虫萤光素酶具有较长的氨基酸序列，在对其进行分析及突变改造的前期工作中，本发明专利技术人考虑了大量的位点，针对各个位点进行独立地或组合地分析及实验，确定了K357E、P394A和D34V三个突变位点。本发明专利技术的萤火虫萤光素酶突变体具有活性高、稳定性高的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种新型萤火虫萤光素酶突变体、其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，更具体地，本专利技术涉及一种新型萤火虫萤光素酶突变体、其制备方法和应用。
技术介绍
萤火虫萤光素酶(FireflyLuciferase)是一种在三磷酸腺苷(ATP)、二价金属离子如镁离子和氧气的存在下催化氧化萤火虫萤光素并使其产生生物发光的酶。在过量的萤火虫萤光素酶和萤光素存在的情况下，萤光的产生和反应中存在的ATP的量成正比，这种发光特性使得萤火虫萤光素酶在各种测定ATP的研究、生产等过程中广泛应用。为了提高萤火虫萤光素酶在ATP检测中的实用性，已有的研究在野生型萤火虫萤光素酶上制作了各种突变体，以提高萤火虫萤光素酶的性能(CN105200022A、CN105368852B、CN100516223C)和发光强度(CN102191213A)等，也利用基因工程等技术在萤火虫萤光素酶的制备方法上做了大量的研究(CN101993858A)，萤火虫萤光素酶的稳定性、活性和产量等都有了一定程度的改进。然而，随着技术的进步，本领域中对于细胞活力检测等提出了更高的要求本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种萤火虫萤光素酶突变体，其是：/n(a)氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1所示的萤火虫萤光素酶，选自下组的位点或位点组合发生突变的酶：第357位，第394位或第34位；/n(b)将(a)酶的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)酶的功能/活性的由(a)衍生的酶，但对应于SEQ ID NO:1所示的萤火虫萤光素酶的第357位，第394位或第34位的氨基酸与(a)酶相应位置突变后的氨基酸相同；/n(c)与(a)酶的氨基酸序列有85％以上同源性且具有(a)酶功能/活性的由(a)衍生的酶，但对应于SEQ ID NO:1所示的萤火虫萤光素酶的第357位，第3...

【技术特征摘要】
1.一种萤火虫萤光素酶突变体，其是：
(a)氨基酸序列对应于SEQIDNO:1所示的萤火虫萤光素酶，选自下组的位点或位点组合发生突变的酶：第357位，第394位或第34位；
(b)将(a)酶的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)酶的功能/活性的由(a)衍生的酶，但对应于SEQIDNO:1所示的萤火虫萤光素酶的第357位，第394位或第34位的氨基酸与(a)酶相应位置突变后的氨基酸相同；
(c)与(a)酶的氨基酸序列有85％以上同源性且具有(a)酶功能/活性的由(a)衍生的酶，但对应于SEQIDNO:1所示的萤火虫萤光素酶的第357位，第394位或第34位的氨基酸与(a)酶相应位置突变后的氨基酸相同；或
(d)在(a)酶的氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。


2.如权利要求1所述的萤火虫萤光素酶突变体，其特征在于，第357位由Lys突变为Glu；第394位由Pro突变为Ala；第34位由Asp突变为Val；较佳地，所述的萤火虫萤光素酶突变体包括：SEQIDNO:3，SEQIDNO:4或SEQIDNO:2。


3.分离的多核苷酸，所述的核酸编码权利要求1或2所述的萤火虫萤光素酶突变体。


4.一种载体，它含有权利要求3所述的多核苷酸。


5.一种遗传工程化的宿主细胞，它含有权利要求4所述的载体，或基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。


6.一种提高萤火虫萤光素酶的活性或信号稳定性的方法，包括对其进行突变改造，对应于SEQIDNO:1所示的萤火虫萤光素酶，对选自下组的位点或位点组合进行突变：第357位，第394位或第34位。


7.权利要求1或2所述的萤火虫萤光素酶突变体的制备方法，该方法包含：
(i)培养权利要求5所述的宿主细胞；
(ii)收集含有所述的萤火虫萤光素酶突变体的培养物；
(iii)从培养物中分离出所述的萤火虫萤光素酶突变体。


8.权利要求1或2所述的萤火虫萤光素酶突变体、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物的用途，用于催化氧化萤火虫萤光素酶底物、产生ATP依赖性生物发光。


9.一种催化氧化萤火虫萤光素、产生生物发光的方法，包...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛新建，余方荣，
申请(专利权)人：上海碧云天生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31