一种检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针及其制备方法和应用，所述荧光分子探针结构式如式（1）所示：式（1）。本发明专利技术的这种荧光分子探针突出的光控特点有助于实时监测可能因DNA周围还原应激下Cys的表达异常而导致DNA复制过程出现差错而引起的疾病，并有望应用于有关Cys表达异常而导致的基因疾病的预防、治疗等。治疗等。

【技术实现步骤摘要】
一种检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及半胱氨酸检测
，具体涉及一种检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]半胱氨酸（Cys）作为一种生物硫醇在蛋白质合成、解毒、代谢、信号转导和基因调控等生物过程中发挥着重要作用。此外，Cys还对蛋白质的氧化还原状态和蛋白质结构的调控起着至关重要的作用。更重要的是，它参与许多重要功能的实现，例如，半胱氨酸（Cys）与多种人类疾病有关，如神经毒性、皮肤损伤、水肿、肌肉无力、嗜睡、生长缓慢、毛发脱色、心血管和阿尔茨海默病等。
[0004]近年来，分子荧光探针因为其高灵敏、高选择性和反应迅速等优点得到迅速发展，但大多数报道的探针都是在短波长下激发和发射。后来，因近红外激发和发射荧光探针对细胞和组织穿透深度深、组织自荧光和自吸收低以及对细胞损伤小等显著优点获得较多关注。除此之外，本专利技术人发现大多数检测Cys的荧光探针只能检测肿瘤细胞大环境下的Cys，而难以检测细胞器或亚细胞器内还原应激微环境下产生的Cys，然而，还原应激微环境下的Cys对揭示其循环作用更加重要。

技术实现思路

[0005]针对上述的问题，本专利技术提供一种检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针及其制备方法和应用，其突出的光控特点有助于实时监测可能因DNA周围还原应激下Cys的表达异常而导致DNA复制过程出现差错而引起的疾病，并有望应用于有关Cys表达异常而导致的基因疾病的预防、治疗等。为实现上述目的，本专利技术公开如下的技术方案：在本专利技术的第一方面，提供一种检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针（简称为CPC），其结构式如式（1）所示：
式（1）。
[0006]在本专利技术的第二方面，提供一种检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针（CPC）的制备方法，包括如下步骤：（1）将溶解了三氯氧磷的CH2Cl2溶液冷却的溶剂中，完成后继续加入环己酮，并将得到的混合液加热回流，完成后对得到的反应液冷却结晶，得到的固体产物记为产物1，备用。
[0007]（2）将2,3,3
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三甲基吲哚和碘乙烷溶解在甲苯中，将得到的混合物加热回流，完成后将得到的反应液冷却结晶，将得到的固体产物洗涤干净，记为产物2，备用。
[0008]（3）将所述产物1、产物2、乙酸钠溶解在乙酸酐中，将得到的混合物进行加热反应，完成后将得到的反应液冷却结晶，将得到的固体产物洗涤干净后烘干，记为产物3，备用。
[0009]（4）Cy7和乙酸钠溶于无水溶剂中，然后在保护气氛中将得到的混合物加热反应，完成后用饱和碘化钾溶液洗涤得到的反应液，再用二氯甲烷萃取反应液，将得到的萃取液进行浓缩，然后对得到的固体产物进行纯化，纯化后产物记为产物4，备用。
[0010]（5）将4
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溴甲基
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硝基苯甲酸、二氯甲烷和DMF混合后冷却，然后加入草酰氯，待气体逸出停止，对反应液搅拌，反应完成后浓缩反应液，得4
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溴甲基
‑3‑
硝基苯甲酰氯，备用。
[0011]（6）将所述产物4溶解在无水二氯甲烷中，然后在保护气氛下先加入三乙胺，再加入溶解在无水二氯甲烷中的所述4
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溴甲基
‑3‑
硝基苯甲酰氯，并使反应在低于室温的冷却环境中进行，待反应液由红色变为绿色后继续在所述冷却环境下静置，然后将反应液恢复至室温并静置，反应完成后除去溶剂，对得到的固体产物进行纯化，纯化后产物记为产物5，备用。
[0012]（7）在二氯甲烷和在碳酸氢钠存在下，于保护气氛中用苯丁酸氮芥与所述产物5反应，反应结束后除去反应液中溶剂，对得到的固体产物进行纯化，即得所述荧光分子探针（简称为CPC）。
[0013]进一步地，所述步骤（1）中，加热回流的温度为20~40℃，时间为3~5h（小时，下同）。在本专利技术中，通过加热回流不仅有助于提高反应物的利用率，提高转化率，而且有助于减少反应物混入生成物中，提高产物的纯度。
[0014]进一步地，所述步骤（1）中，所述混合溶剂包括DMF和CH2Cl2，混合溶剂的温度需要
控制在零下15~10℃；可选地，所述CH2Cl2和DMF的体积比=1:1~3:1。
[0015]进一步地，所述步骤（1）中，CH2Cl2溶液中三氯氧磷的浓度为0.3~0.9 μmol/L。
[0016]进一步地，所述步骤（2）中，2,3,3
‑
三甲基吲哚和碘乙烷的摩尔比为5:9~2:3。
[0017]进一步地，所述步骤（2）中，加热回流的温度为80~100℃，时间为20h。同样地，本步骤中通过加热回流，不仅有助于提高反应物的利用率，提高转化率，而且有助于减少反应物混入生成物中，提高产物纯度。
[0018]进一步地，所述步骤（2）中，可以采用石油醚、DMF等中的任意一种对结晶得到的固体产物进行洗涤，以去除产物表面的残留液。
[0019]需要说明的是，所述（1）、（2）步骤中，产物1和产物2的制备顺序并无严格的眼球，即可以先制备产物1，再制备产物2，也可以先制备产物2，再制备产物1，或者产物1和产物2同时制备。基于此，上述（1）、（2）步骤的排序主要目的是便于技术方案的说明，并不构成特定的步骤执行顺序的限定。
[0020]进一步地，所述步骤（3）中，产物1、产物2、乙酸钠的添加比例依次序为1：3：0.5，摩尔比。所述乙酸酐的添加量能够充分溶解产物1、产物2和乙酸钠即可，技术人员可根据实际需要进行选择，本专利技术不做具体限定。
[0021]进一步地，所述步骤（3）中，所述加热反应温度为50~80℃，时间为3h；优选地，反应过程中对反应液进行搅拌，有助于促进反应进行。
[0022]进一步地，所述步骤（3）中，采用饱和的碳酸氢钠缓冲液洗涤固体产物，直到没有气泡出现，然后将固体产物用水洗涤后烘干，即可。通过采用饱和的碳酸氢钠缓冲液作为洗涤液有助于提纯和提高产率。
[0023]进一步地，所述步骤（4）中，Cy7和乙酸钠的摩尔比为1:2，反应全程以铝箔操作，并暗箱避光。
[0024]进一步地，所述步骤（4）中，无水溶剂包括DMF、DMSO等中任意一种。需要说明的是，在溶解所述花菁荧光团和乙酸钠时，无水溶剂的添加量同样能够充分溶解花菁荧光团和乙酸钠即可，本专利技术不做具体限定。
[0025]进一步地，所述步骤（4）中，加热反应温度为80~90℃，时间为5h。
[0026]进一步地，所述步骤（5）中，冷却温度为0℃，以提高产率和保障安全。
[0027]进一步地，所述步骤（6）中，产物4、三乙胺、溶解在无水二氯甲烷中的4
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溴甲基
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针，其结构式如式（1）所示：式（1）。2.一种检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将溶解了三氯氧磷的CH2Cl2溶液冷却的溶剂中，完成后继续加入环己酮，并将得到的混合液加热回流，完成后对得到的反应液冷却结晶，得到的固体产物记为产物1，备用；（2）将2,3,3
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三甲基吲哚和碘乙烷溶解在甲苯中，将得到的混合物加热回流，完成后将得到的反应液冷却结晶，将得到的固体产物洗涤干净，记为产物2，备用；（3）将所述产物1、产物2、乙酸钠溶解在乙酸酐中，将得到的混合物进行加热反应，完成后将得到的反应液冷却结晶，将得到的固体产物洗涤干净后烘干，记为产物3，备用；（4）Cy7和乙酸钠溶于无水溶剂中，然后在保护气氛中将得到的混合物加热反应，完成后用饱和碘化钾溶液洗涤得到的反应液，再用二氯甲烷萃取反应液，将得到的萃取液进行浓缩，然后对得到的固体产物进行纯化，纯化后产物记为产物4，备用；（5）将4
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硝基苯甲酸、二氯甲烷和DMF混合后冷却，然后加入草酰氯，待气体逸出停止，对反应液搅拌，反应完成后浓缩反应液，得4
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硝基苯甲酰氯，备用；（6）将所述产物4溶解在无水二氯甲烷中，然后在保护气氛下先加入三乙胺，再加入溶解在无水二氯甲烷中的所述4
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硝基苯甲酰氯，并使反应在低于室温的冷却环境中进行，待反应液由红色变为绿色后继续在所述冷却环境下静置，然后将反应液恢复至室温并静置，反应完成后除去溶剂，对得到的固体产物进行纯化，纯化后产物记为产物5，备用；（7）在二氯甲烷和在碳酸氢钠存在下，于保护气氛中用苯丁酸氮芥与所述产物5反应，反应结束后除去反应液中溶剂，对得到的固体产物进行纯化，即得所述荧光分子探针。3.根据权利要求2所述的检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，加热回流的温度为20~40℃，时间为3~5h；或者，所述步骤（1）中，所述混合溶剂包括DMF和CH2Cl2，混合溶剂的温度需要控制在零下15~10℃；优选地，所述CH2Cl2和DMF的体积比=1:1~3:1；或者，所述步骤（1）中，CH2Cl2溶液中三氯氧磷的浓度为0.3~0.9 μmol/L；...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈光，孟令柱，赵光辉，李璐，许洁，王思妙，
申请(专利权)人：曲阜师范大学，
类型：发明
国别省市：