一种稳定高产石斛碱的内生菌与金钗石斛原球茎共培养方法技术

本发明专利技术公开了一种稳定高产石斛碱的内生菌与金钗石斛原球茎共培养方法，在本发明专利技术中金钗石斛原球茎的植物生物反应器体系构建高产石斛碱的产品替代传统金钗石斛的农业生产方式，目前尚未有关于金钗石斛原球茎与其内生菌通过植物生物反应器共培养高效生产石斛碱等有重要药用价值的次生代谢化合物的文献报道，具有原始创新性，将影响金钗石斛的内生菌、营养条件、生长条件三者结合起来，通过响应面法等新方法来筛选适合与高效稳定生产生物碱的方法与体系，优化现有培养基配方、培养条件，提高石斛碱的产量。高石斛碱的产量。高石斛碱的产量。

【技术实现步骤摘要】
一种稳定高产石斛碱的内生菌与金钗石斛原球茎共培养方法


[0001]本专利技术涉及内生菌与金钗石斛原球茎共培养
，具体为一 种稳定高产石斛碱的内生菌与金钗石斛原球茎共培养方法。

技术介绍

[0002]植物组织培养包括单细胞培养、胚培养、根尖培养、茎尖培养、 愈伤组织培养、细胞悬浮培养、花药培养、原生质体培养等不同方法， 而在石斛组织培养中，大多数石斛属植物的种子、茎、叶诱导出愈伤 组织、原球茎、幼苗等组培材料，其中，原球茎来源广泛，可从种子、 茎、叶、拟原球茎等组织诱导而来，同时也具有优良脱分化能力，在 脱分化能力上仅低于种子，高于愈伤、拟原球茎、茎等，容易在激素 的作用下改变分化途径。
[0003]目前石斛碱是金钗石斛内生菌与植物均能自行独立合成的次生 代谢产物，由此推知石斛碱的代谢通路可能是两个材料代谢通路的汇 通点。然而，石斛碱在两个材料中的合成路径如何，这些通路如何协 调统一、机制如何，我们要解答这些问题关键就在于建立高产石斛碱 的金钗石斛原球茎与内生菌共培养体系，并对该体系进行转录组学分 析，因此我们提出了一种稳定高产石斛本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种稳定高产石斛碱的内生菌与金钗石斛原球茎共培养方法，其特征在于，所述高产石斛碱的内生菌与金钗石斛原球茎共培养方法包括以下步骤：S1：对金钗石斛原球茎制备，选用金钗石斛蒴果，并建立种子诱导原球茎与增值培养体系，并在此基础上绘制原球茎生长曲线，利用GC/MS方法鉴定其中石斛碱的含量；S2：较高繁殖系数金钗石斛原球茎制备，培养基成分与激素类型、用量是影响植物组织培养最主要的因素之一，对生长状态进行描述和绘制生长曲线；S3：金钗石斛原球茎中石斛碱含量测定，以标品石斛碱作为对照，并进行标准曲线制作；S4：分离金钗石斛内生菌并鉴定其次生代谢产物，将纯化后的菌种划线取样、涂片，在显微镜下观察形态，记录；S5：金钗石斛中内生菌次生代谢产物鉴定，同时将菌种转至真菌液体培养基中,28℃培养7
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15d,将菌样、培养液分别提取产物，进行GC/MS分析，并与金钗石斛茎段次生代谢产物、石斛碱标品进行比较分析，挑选次生代谢产物中含有石斛碱的菌种作为共培养的候选菌株；S6：建立金钗石斛原球茎与内生菌的共培养体系选用在生长曲线中处于上升期的原球茎，转入植物生物反应器中，接种金钗石斛的内生菌，添加液体培养基，温度25℃，采用间歇式浸没法进行共培养，在共培养前后检测金钗石斛原球茎的干湿重变化，检测其中的石斛碱含量；S7：优良菌株筛选，将S6得到的候选菌株转入添加有金钗石斛原球茎的培养瓶中，分别记录接种后7
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15d原球茎干湿重变化、其中石斛碱含量变化，以石斛碱得率最高的菌株作为共培养体系的受试菌；S8：共培养体系优化，以原球茎的生长时期、相对接种量、液体培养基组成、培养温度等作为参数，结合GC/MS检测得到石斛碱的得率进行正交实验设计、响应面法优化共培养体系；S9：内生菌与金钗石斛原球茎高产石斛碱网络绘制，进行转录组学检测；S10：转录组学分析，将组装得到的所有Unigenes，与NCBI的Nr(非兀余蛋白数据库)、Nt(非冗余核酸数据库)数据库、Swissprot蛋白数据库、COG数据库以及KEGG蛋白数据库分别进行比对，对unigenes进行功能注释及GO富集分析，同时对三代转录组得到的数据对其中的转录剪切、单基因变异等信息进行进一步补充，完善转录组数据信息；S11：绘制石斛碱积累的功能基因代谢网络，以KEGG等数据库为依托，结合RNA
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Seq揭示的基因表达差异信息，进行代谢通路分析，采用DAV...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈集双，贾启，朱洁莹，舒福兴，
申请(专利权)人：遵义医科大学，
类型：发明
国别省市：