7β-羟基类固醇脱氢酶筛选方法、编码基因及应用技术

本发明专利技术公开了一种7β-羟基类固醇脱氢酶筛选方法、编码基因及其在制备熊去氧胆酸及中间体中的应用；本发明专利技术提供了一种基于7β-羟基类固醇脱氢酶蛋白三级结构的筛选方法，通过该方法挖掘了来源于Libanicoccus massiliensis、Clostridium sp.CL-2、Clostridium butyricum的7β-羟基类固醇脱氢酶，所述氨基酸序列如SED ID NO:1-3所示，为此类酶的筛选提供了新的解决方案，大幅提升基因挖掘效率；通过上述系列7β-羟基类固醇脱氢酶可立体选择性催化熊去氧胆酸中间体C-7羰基生成7β-羟基，具有光学纯度高、条件温和、环境友好等优点。好等优点。

【技术实现步骤摘要】
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β-羟基类固醇脱氢酶筛选方法、编码基因及应用


[0001]本专利技术涉及7β-羟基类固醇脱氢酶的筛选方法、编码基因及应用，特别涉及一种基于7β
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羟基类固醇脱氢酶三维模型的筛选方法、编码基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及该酶或含有该酶的重组细胞制备熊去氧胆酸及其中间体中的应用。

技术介绍

[0002]熊去氧胆酸是一种来自熊胆的次级胆汁酸，由初级胆汁酸经细菌代谢生成，在临床上主要用于胆结石、反流性胃炎、胆源性胰腺炎、脂肪性肝病、药物性肝病及病毒性肝炎等胆汁淤积性肝病。
[0003]经典的化学法制备熊去氧胆酸工艺以胆酸为原料，共需7步工艺制得。由于化学氧化是非选择性的，胆酸上的羧基和3α、7α-羟基在制备过程中必须经过反复保护和脱保护，且7
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酮-石胆酸的催化加氢步骤选择性不佳，工艺路线冗长，工艺总收率仅为27-32％。此外，中间产物7-酮-石胆酸的还原需利用金属钠或者Pd/C催化氢化，工业化放大生产不易控制，存在安全隐患。
[0004]随着分子生物学及蛋白定向进化技术的蓬勃发展，生物酶法在制备医药中间体方面的得到广泛应用。根据文献检索结果，基于酶法制备熊去氧胆酸的工艺主要有3条，如下所示：
[0005][0006]路线a是一条化学酶法制备熊去氧胆酸的工艺路线，由Sun B等人报道(Biotechnology and bioengineering,2013,110:68-77)。首先利用次氯酸钠将胆酸氧化成去氢胆酸，后利用Comanomonas testosteroni 3α-羟基类固醇脱氢酶(HSDH)和Collinsella aerofaciens 7β-HSDH 将去氢胆酸还原成12-酮-熊去氧胆酸，最后通过wolff-kishner反应获得最终产物。
[0007]路线b同样是一条以胆酸为出发底物的化学酶法路线(Advanced Synthesis&Catalysis, 2009,351:1303-1311)。首先利用Bacteroides fragilis 7α-HSDH和商品化12α-HSDH(Genzyme Biochemicals Ltd.)氧化胆酸制备7,12-二酮-3α-胆烷酸，之后利用Clostridium absonum 7β-HSDH还原制备12-酮-熊去氧胆酸，最后通过wolff-kishner反应获得最终产物。
[0008]路线c是一条全生物酶法催化路线，随着国内鹅去氧胆酸价格持续下降，近年来国内主要以此路线制备熊去氧胆酸。CN105368828A利用Escherichia coli 7α-HSDH先对鹅去氧胆酸7α
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羟基进行氧化，之后利用Ruminococcus gnavus 7β-HSDH将7-酮-石胆酸还原成熊去氧胆酸。
[0009]综合3条化学酶法路线和熊去氧胆酸分子结构，所有酶法制备工艺中均需要7β-HSDH作为生物催化剂。作为工艺中的关键酶，目前报道的7β-HSDH来源非常有限，限制了熊去氧胆酸酶法制备工艺的开发。
[0010]据文献报道，来源于Collinsella aerofaciens的7β-HSDH(PDB编号：5FYD)已经完成蛋白晶体解析工作(Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics,2016,84(6):859-865)。对比来源于E.coli的7α-HSDH(PDB编号：1AHH；Biochemistry,1996 35(24):7715-7530) 和7β-HSDH的晶体结构，在一级结构水平并没有显著区别，均具备短链脱氢酶家族 (Short-chain dehydrogenase superfamily,SDR superfamily)NAD(P)-的保守结合域；尽管两类酶展现出完全相反的立体选择性，但是在进化关系和催化残基的结构上并无显著差异。我们对晶体结构进行进一步解析后发现两类酶在蛋白的C-端表现出极大的分别，7β-HSDH的C
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端包含两个有序的α-螺旋结构(图1)，而7α-HSDH的C-端并无此特征，呈无规则卷曲结构 (图2)。分子对接结果表明，此特征区域恰好处于底物进入催化中心的通道上，推测是该特征结构影响了底物进入催化口袋的方式，造成完全不同的立体选择性。因此可利用同源建模对比HSDH蛋白C-端特征结构进一步确定7β-HSDH的立体选择性。
[0011]现阶段7β-HSDH基因挖掘法主要根据已知序列比对的方式进行筛选，但同源性高的序列并不等同于相同的催化功能，仅选择同源性高的序列进行表达意味着错过更多7β-HSDH新酶，不确定性高。因此，开发一种基于三维模型的高效7β-HSDH序列筛选方法，挖掘催化性能良好的新型7β-HSDH，应用于熊去氧胆酸及其中间体的酶法制备工艺，具有重大的学术意义和应用价值。

技术实现思路

[0012]本专利技术的目的在于开发一种针对7β-HSDH高效基因挖掘法，筛选获得系列7β-HSDH新酶，并且能立体选择性还原熊去氧胆酸中间体C-7羰基生成7β-羟基，为熊去氧胆酸的化学酶法制备工艺提供更多酶源选择。
[0013]本专利技术采用的技术方案是：
[0014]本专利技术所述基于三维模型的7β-HSDH基因挖掘法通过检索NCBI和蛋白质PDB数据库获取已确定功能的7β-HSDH序列及蛋白晶体结构，选定模板序列并在NCBI数据库中进行氨基酸序列比对，选取同源性介于30-80％标注为SDR superfamily的序列，进一步筛选催化三联体S-Y-K及G-X-X-X-G-X-G特征性辅酶结合位点；特别的，将候选序列进行同源建模，通过分析比对7β-HSDH三维蛋白模型C-端特征性双α-螺旋结构，获得7β-HSDH候选序列。
[0015]本专利技术提供了来源于Libanicoccus massiliensis，Clostridium sp.CL-2，Clostridium butyricum 的7β-HSDH，通过上述基因挖掘法获得，将所选7β-HSDH进行全基因合成，构建重组大肠杆菌细胞，并验证7β-HSDH活力，所述的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1-3所示。
[0016]由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ NO：1-3所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上，均属于本专利技术保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
[0017]本专利技术还设计所述7β-HSDH的编码基因。具体的，所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO： 4-6所示。
[0018]由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO：4-6所示多本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种7β-羟基类固醇脱氢酶基因挖掘筛选方法，其特征在于所述方法为：以已解析蛋白晶体结构的7β-羟基类固醇脱氢酶作为筛选模板，在NCBI及PDB数据库中进行同源比对，进一步筛选含催化三联体S-Y-K及G-X-X-X-G-X-G特征性辅酶结合位点的序列，通过同源建模，对比三维蛋白模型C-端特征性双α-螺旋结构，筛选获得新型7β-羟基类固醇脱氢酶。2.如权利要求1所述的方法筛选获得的7β-羟基类固醇脱氢酶，分别来源于Libanicoccus massiliensis，Clostridium sp.CL-2，Clostridium butyricum，...

【专利技术属性】
技术研发人员：阮礼涛，钟胡军，丁扬阳，陈茜，顾虹，
申请(专利权)人：上海奥博生物医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：