一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白、其制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白、其制备方法及其应用。所述的生物活性蛋白为酸酐化乳铁蛋白、酸酐化乳清蛋白或酸酐化组蛋白，所述的酸酐化是采用4‑羟基苯酐、4‑羟基苯酐的衍生物、琥珀酸酐或马来酸酐对蛋白进行修饰而得。本发明专利技术的生物活性蛋白具有阻断HPV病毒入侵细胞、阻止病毒扩大感染、抗菌、抗氧化、安全、稳定、便于保存和运输、成本低等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白、其制备方法及其应用
本专利技术涉及一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白、其制备方法及其应用，属于医药

技术介绍
人乳头瘤病毒(Humanpapillomaviruses,HPV)是少数几种明确与人类癌症相关的病毒之一,其持续感染是导致宫颈癌发生的重要危险因素。据统计，在所有宫颈癌的患者中，超过99％的病例可被检测到高危型HPVDNA。大约50％以上性生活活跃的女性一生中都曾有过HPV感染，持续性高危型HPV感染者患宫颈癌的风险增加100-300倍。因此，及早干预和清除HPV感染对于宫颈病变CIN的预防非常重要。目前针对HPV感染的治疗较多，其中局部用药为常用方法之一，药物种类繁多，但临床治愈率均不理想。目前已有商品化的二价(HPV-16、18型)或四价HPV疫苗(HPV-6、11、16和18型)，可用于预防同型别病毒感染。但疫苗价格过高，特定疫苗对其他型HPV的疫苗无交叉免疫。目前上市销售预防和治疗人乳头瘤病毒感染的药物和生物制剂较少，仍需开发新的药物和生物制剂。中国专利201510537630.7提供了一种电荷修饰的乳铁蛋白与卡拉胶组合药物及其制备方法，此专利技术公开了一种电荷修饰的乳铁蛋白与卡拉胶组合药物，包括0.01重量份的LK蛋白、1.5重量份的卡拉胶、5重量份的卡波姆、50重量份的甘油、0.1重量份的尼泊金乙酯。该组合药物为凝胶剂、栓剂、敷料中一种。该专利中所用的LK蛋白是通过3-羟基-邻苯二甲酸酐对乳铁蛋白进行修饰，由于3-羟基-邻苯二甲酸酐空间位阻大，活性较低，对乳铁蛋白的修饰效果不佳，影响抗HPV病毒的效果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白、其制备方法及其应用。本专利技术的技术思路如下：酸酐化乳铁蛋白来源于牛奶蛋白，经过酸酐化修饰后得到的乳铁蛋白表面带有更多的负电荷，与HPV衣壳蛋白的L1区的C端L2区的N端的正电荷区域相结合，阻断病毒侵入宿主细胞内的过程，从而达到阻断HPV感染的目的。专利技术人通过大量研究工作，意外发现了一种对乳铁蛋白的修饰效果更佳的酸酐，得到的酸酐化乳铁蛋白具有更好的抗HPV病毒的效果。本专利技术的技术方案如下：一种用于预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白，所述的生物活性蛋白为酸酐化乳铁蛋白、酸酐化乳清蛋白或酸酐化组蛋白，所述的酸酐化是采用4-羟基苯酐、4-羟基苯酐的衍生物、琥珀酸酐或马来酸酐对蛋白进行修饰而得。优选地，本专利技术中，用于预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白，为4-羟基苯酐修饰的乳铁蛋白。本专利技术中，所述的4-羟基苯酐修饰的乳铁蛋白为酸酐化乳铁蛋白冻干粉，所述的酸酐化乳铁蛋白冻干粉的制备方法如下：在温度为25-50℃的条件下，将4-羟基苯酐溶于二甲基亚砜中，得到饱和的4-羟基苯酐溶液；将乳铁蛋白溶于0.1M磷酸三钠溶液中，得到终浓度为30-80mg/mL的蛋白溶液；将上述4-羟基苯酐溶液加入蛋白溶液中，搅拌混匀，4-羟基苯酐在反应体系中的终浓度为30-80mM，静置反应2小时；得到酸酐化乳铁蛋白；用0.45uM滤膜抽滤除菌后使用pH7.2磷酸盐缓冲液进行超滤置换纯化(所用超滤膜截留分子量为10KD)或离子交换纯化；再用0.45uM微孔滤膜抽滤除菌，加入保护剂使用冷冻干燥机进行冷冻干燥，收集冻干粉，即得酸酐化乳铁蛋白冻干粉。本专利技术中，所述蛋白冻干步骤包括以下阶段：预冻阶段：隔板温度下降到-70℃，保持时间6h；一次升华阶段：保持12h；二次升华阶段：保持7h。所述的冻干保护剂为甘露醇、蔗糖、葡萄糖、海藻糖或果糖。本专利技术还提供了上述生物活性蛋白在制备预防和治疗人乳头瘤病毒感染药物中的应用。应用时，可以将上述生物活性蛋白制成制剂进行应用，所述的制剂中含有药学上有效剂量的生物活性蛋白和药学上可接受的辅料或辅助性成分。本专利技术中，所述的制剂可以为液体制剂、膏剂、凝胶剂或栓剂。例如，为了制备用于外用给药的固体剂型,可以使用卡波姆、卡拉胶、麦芽糊精、羟丙基甲基纤维素、明胶等本领域已知的固体载体。另外，还可以使用和活性成分或已使用的成分相容的任何其它通常用于防腐等目的的载体。为了制备用于外用给药的液体剂型，可以使用水、乙醇、甘油、丙二醇等以及本领域己知的液体载体。优选地，所述的制剂为敷料，所述的生物活性蛋白为4-羟基苯酐修饰的酸酐化乳铁蛋白，所述敷料的组分及其重量百分含量如下：酸酐化乳铁蛋白冻干粉0.01-0.1％，卡波姆9341-2％，甘油0.5％-2％以及余量的纯化水。所述的敷料的制备方法，包括如下步骤：1)将卡波姆放入纯化水中搅拌，静置溶解。2)将酸酐化乳铁蛋白加入适量纯化水溶解后，加入到步骤1)的溶液中，再加入甘油搅拌20-60分钟混匀后，加入纯化水搅拌30min，即得敷料。本专利技术的技术效果如下：本专利技术生物活性蛋白具有阻断HPV病毒入侵细胞、阻止病毒扩大感染、安全、稳定、便于保存和运输、成本低等优点。本专利技术的技术方案，与现有技术，即申请号为201510537630.7、专利名称为一种电荷修饰的乳铁蛋白与卡拉胶组合药物相比，具有以下优势:1)本方案在对乳铁蛋白进行修饰的时候，对加入乳铁蛋白的浓度进行了优化，确保乳铁蛋白的负电荷量最大。2)本方案意外发现在对乳铁蛋白进行修饰时采用4-羟基苯酐对蛋白进行修饰，相对于3-羟基邻苯二甲酸酐，4-羟基苯酐空间位阻小，活性提高，而且来源更广，价格更低，对乳铁蛋白的修饰效果更好。3)本方案采用冻干的方法保存酸酐化修饰蛋白。由于酸酐化修饰蛋白溶液在常温或者4℃保存都易降解，难以长期保存。本方案采用冻干的方法保存酸酐化修饰蛋白，解决了蛋白活性长期保存的问题。4)本方案采用超滤置换纯化或离子交换纯化的方法纯化蛋白。现有专利采用透析的方法纯化蛋白，不仅一次处理的蛋白量小，处理时间长，不适合工业化生产，而且不能够根据实际需要，得到不同浓度的纯化蛋白。本方案采用超滤置换纯化或离子交换纯化的方法进行蛋白纯化克服了以上缺点，更有利于工业化生产。综上，本专利技术所述的蛋白制备工艺简单、稳定性好、效果显著、安全可靠，易于推广。所述敷料含有卡波姆，可将失活的HPV吸附、包裹排出体外，并加快受损、糜烂组织快速修复与再生，促进愈合。适用于隔离阻断HPV感染，促进受损、糜烂组织的愈合，对宫颈癌的发生有预防、治疗作用。附图说明图1为采用3-羟基邻苯二甲酸酐得到的修饰蛋白电位检测结果。图2为采用4-羟基苯酐修饰得到的修饰蛋白电位检测结果。图3为AntiHPVE7抗体检测结果。其中，1正常Hela细胞样；2为1mg/ml样品24hr细胞总蛋白样；3为1mg/ml样品48hr细胞总蛋白样；4为0.5mg/ml样品24hr细胞总蛋白样；5为0.5mg/ml样品48hr细胞总蛋白样；6为0.25mg/ml样品24hr细胞总蛋白样；7本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白，其特征在于，所述的生物活性蛋白为酸酐化乳铁蛋白、酸酐化乳清蛋白或酸酐化组蛋白，所述的酸酐化是采用4-羟基苯酐、4-羟基苯酐的衍生物、琥珀酸酐或马来酸酐对蛋白进行修饰而得。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于预防和治疗人乳头瘤病毒感染的生物活性蛋白，其特征在于，所述的生物活性蛋白为酸酐化乳铁蛋白、酸酐化乳清蛋白或酸酐化组蛋白，所述的酸酐化是采用4-羟基苯酐、4-羟基苯酐的衍生物、琥珀酸酐或马来酸酐对蛋白进行修饰而得。


2.根据权利要求1所述的生物活性蛋白，其特征在于，所述的生物活性蛋白为4-羟基苯酐修饰的乳铁蛋白。


3.根据权利要求2所述的生物活性蛋白，其特征在于，所述的4-羟基苯酐修饰的乳铁蛋白为酸酐化乳铁蛋白冻干粉，所述的酸酐化乳铁蛋白冻干粉的制备方法如下：在温度为25-50℃的条件下，将4-羟基苯酐溶于二甲基亚砜中，得到饱和的4-羟基苯酐溶液；将乳铁蛋白溶于0.1M磷酸三钠溶液中，得到终浓度为30-80mg/mL的蛋白溶液；将上述4-羟基苯酐溶液加入蛋白溶液中，搅拌混匀，4-羟基苯酐在反应体系中的终浓度为30-80mM，静置反应2小时；得到酸酐化乳铁蛋白；用0.45uM滤膜抽滤除菌后使用pH7.2磷酸盐缓冲液进行超滤置换纯化(所用超滤膜截留分子量为10KD)或离子交换纯化，；再用0.45uM微孔滤膜抽滤除菌，加入保护剂使用冷冻干燥机进行冷冻干燥，收集冻干粉，即得酸酐化乳铁蛋白冻干粉。


4.根据权利要求3所述的生物活性蛋白，其特征在于，所述蛋白冻干步骤包括以下阶段：预冻阶段：隔板温度下降到-70℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：王曙蒙，常天安，陈海鹏，曹丹枫，魏赵延，徐倩，
申请(专利权)人：王曙蒙，
类型：发明
国别省市：江苏;32