一种用于电化学发光检测的磁珠改性标记方法技术

本发明专利技术公开了一种用于电化学发光检测的磁珠改性标记方法，属于电化学检测材料技术领域。所述的磁珠改性标记方法，特征步骤为：1）将羟基被保护基PG保护的羟基酸活化酯和带有反应基团X的酸的活化酯，与氨基磁珠表面的氨基通过成酰胺键反应，将氨基磁珠表面的氨基完全反应掉形成改性氨基磁珠（I）；2）将改性氨基磁珠（I）进行脱羟基保护基PG游离出羟基，得到表面是部分羟基和部分反应基团X的磁珠（II）；3）将被反应基团Y修饰的蛋白质分子链霉亲和素SA与磁珠表面的X基团进行标记反应得到用于电化学发光检测的磁珠；所述反应基团Y与反应基团X能够形成化学键。本发明专利技术标记后的磁珠可以明显改善通电后磁珠清洗后的残留。

【技术实现步骤摘要】
一种用于电化学发光检测的磁珠改性标记方法
本专利技术属于电化学检测材料
，更具体的涉及一种用于电化学发光检测的磁珠改性标记方法。
技术介绍
在使用磁珠进行的电化学发光检测中，通电之后磁珠在电极表面发生氧化还原反应。在这一过程中，会导致电极表面和磁珠表面产生电磁相互作用，从而使得磁珠吸附在电极表面，导致检测后电极表面不易清洗干净。残余磁珠使得检测背景增高，降低了仪器的检出限，因此必须得到解决。目前有很多公司提供链霉亲和素或抗体标记的磁珠，也有多种比较成熟的磁珠表面蛋白质标记技术。传统的磁珠上标记蛋白的办法，通常是使用羧基磁珠，使用缩合试剂如DCC，EDC和活化试剂如HOBT、HOSu等的缩合试剂对羧基进行活化，再与蛋白质分子表面的氨基进行偶联反应。然而，由于蛋白质标记通常在水溶液中进行，磁珠表面的活化酯在标记过程中大部分会水解重新变成羧基，因此会增加标记后磁珠的电极表面残留。由于使用磁珠进行的电化学发光检测目前基本由罗氏诊断所垄断，因此市面上很难找到专门针对电化学发光检测而优化过的磁珠产品。申请人测试的磁珠产品和样品也基本上都只是为化学发光或者核酸检测而开发的，这些产品在我们的测试中都有很严重的电极表面残留。当我们对未做修饰的羟基磁珠、羧基磁珠以及氨基磁珠悬浊液加到金电极表面，进行通电测试（-1-2.5V）后，用清洗液洗涤，可观察到三种磁珠在金电极表面的残留程度：氨基磁珠>羧基磁珠>>羟基磁珠。针对电化学发光的特殊性，本专利技术申请人研究了磁珠表面电荷性质和亲水/疏水性质对于电极吸附的影响，设计了全新的标记方法，有效控制了标记后的磁珠表面的残余电荷和疏水基团，从而大大降低了电极表面的磁珠残留。
技术实现思路
本专利技术通过修饰磁珠的表面，实现链霉亲和素或其他蛋白质在磁珠表面的标记，同时增加磁珠表面的亲水性，减少磁珠表面的带电基团和剩余电荷，从而实现有效降低磁珠在电极表面残留的目的。为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用的技术方案为：一种用于电化学发光检测的磁珠改性标记方法，见式（X），包括如下步骤式（X）1）将带有反应基团A的磁珠与化合物L1和封闭基团MSK先后或同时反应得处理后的磁珠；封闭基团MSK带有极性不带电的基团，含有保护基PG或不含保护基PG；2）将带有与化合物L1反应的标记物L2-Lable与步骤1）处理后的磁珠进行标记反应，得到表面封闭的标记磁珠；其中L2与L1反应，Lable为想要标记到磁珠上的分子；当封闭基团MSK含有保护基PG时，所述保护基PG可以在标记反应之前或之后进行，得到最终用于电化学发光检测的标记磁珠；反应基团A选自以下反应基团的一种，包括氨基、羧基、羟基、炔基、叠氮基、卤代烷基、卤代芳基或磺酰基，优选氨基；当反应基团A为氨基时，具体步骤为：1）将羟基被保护基PG保护的羟基酸活化酯（简称羟基活化酯）和带有反应基团X的酸的活化酯（X基团活化酯），与氨基磁珠表面的氨基通过酰胺键反应，将氨基磁珠表面的氨基完全反应掉形成改性氨基磁珠（I）；2）将改性氨基磁珠（I）进行脱羟基保护基PG游离出羟基，得到表面是部分羟基和部分反应基团X的磁珠（II）；3）将被反应基团Y修饰的蛋白质分子链霉亲和素SA与磁珠表面的X基团进行标记反应得用于电化学发光检测的磁珠；所述反应基团Y与X基团能够形成化学键；优选的，所述保护基PG为叔丁氧羰基、苄氧羰基、苄基、三氟甲酰基、苯甲酰基、芴氧羰基、烯丙氧羰基、甲氧羰基、乙氧羰基、乙酰基、特戊酰基、甲氧甲基或4,4'-二甲氧基三苯基甲基中任意一种。优选的，步骤1）中羟基被保护基PG保护的羟基酸活化酯和带有反应基团X的酸的活化酯中，羟基被保护基PG保护的羟基酸活化酯是由羟基被保护基PG保护的羟基酸与酯的活化剂形成，带有反应基团X的酸的活化酯是由带有反应基团X的酸与酯的活化剂形成。优选的，所述羟基被保护基PG保护的羟基酸活化酯为5位被4,4'-二甲氧基三苯基甲基保护的羟基戊酸的活化酯；进一步优选为5位被4,4'-二甲氧基三苯基甲基保护的羟基戊酸的丁二酰亚胺活化酯，即5位被4,4'-二甲氧基三苯基甲基保护的羟基戊酸与N-羟基丁二酰亚胺形成的活化酯。优选的，所述带有反应基团X的酸的活化酯为炔基酸的活化酯；进一步优选为4-戊炔酸的活化酯，更优选为4-戊炔酸的丁二酰亚胺活化酯，即4-戊炔酸与N-羟基丁二酰亚胺形成的活化酯。优选的，所述反应基团Y修饰的蛋白质分子链霉亲和素SA为叠氮修饰的蛋白质分子链霉亲和素SA。所述叠氮修饰的蛋白质分子链霉亲和素SA的制备方法包括如下步骤：将5-叠氮戊酸置于反应管中，加入二环己基碳二亚胺（DCC）、N-羟基丁二酰亚胺（HOSu）和DMF；室温下反应后得到5-叠氮戊酸的N-羟基丁二酰亚胺酯（活化酯）的DMF溶液；将1毫克的链霉亲和素（SA）配置为水溶液，加入制备得到5-叠氮戊酸活化酯的DMF溶液，震荡4-12小时后，经过SephadexG-25脱盐柱纯化得到叠氮修饰的蛋白质分子链霉亲和素SA。优选的，所述羟基被保护基PG保护的羟基酸活化酯为5位被4,4'-二甲氧基三苯基甲基保护的羟基戊酸的丁二酰亚胺活化酯，所述带有反应基团X的酸的活化酯为4-戊炔酸的丁二酰亚胺活化酯，所述反应基团Y修饰的蛋白质分子链霉亲和素SA为叠氮修饰的蛋白质分子链霉亲和素SA。优选的，5位被4,4'-二甲氧基三苯基甲基保护的羟基戊酸的丁二酰亚胺活化酯和4-戊炔酸的丁二酰亚胺活化酯是将4,4'-二甲氧基三苯基甲基保护的羟基戊酸和4-戊炔酸与N-羟基丁二酰亚胺在缩合剂的作用下一锅法制备而成，其中4,4'-二甲氧基三苯基甲基保护的羟基戊酸和4-戊炔酸的摩尔比为1：0.1-5.0；进一步优选为3:1。本专利技术整个标记路线反应条件温和，不会破坏磁珠的化学结构，也不会造成蛋白质分子的失活。通过控制羟基活化酯和X基团活化酯的比例，可以调节磁珠表面的蛋白质载量以及亲水/疏水性、电荷等性能。该种磁珠可以明显改善通电后磁珠清洗后的残留。我们使用商业可得的磁珠进行了通电发光的测试，得到了相应的结果。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的描述。本专利技术设计了如下磁珠标记路线（见下“式1”），以改善磁珠在电极表面残留的问题。一种用于电化学发光检测的磁珠改性标记方法，包括如下步骤：1）将羟基被保护基PG保护的羟基酸活化酯（简称羟基活化酯）和带有反应基团X的酸的活化酯（简称X基团活化酯），与氨基磁珠表面的氨基通过酰胺键反应，将氨基磁珠表面的氨基完全反应掉形成改性氨基磁珠（I）；2）将改性氨基磁珠（I）进行脱羟基保护基PG游离出羟基，得到表面是部分羟基和部分反应基团X的磁珠（II）；3）将被反应基团Y修饰的蛋白质分子链霉亲和素SA与磁珠表面的X基团进行标记反应得用于电化学发光检测的磁珠；所述反应基团Y与X基团能够形成化学键；其技术原理可以见式1所示：整个标记路线反应条件本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于电化学发光检测的磁珠改性标记方法，其特征在于：包括如下步骤：/n1）将带有反应基团A的磁珠与化合物L1和封闭基团MSK先后或同时反应得处理后的磁珠；封闭基团MSK带有极性不带电的基团，含有保护基PG或不含保护基PG；/n2）将带有与化合物L1反应的标记物L2-Lable与步骤1）处理后的磁珠进行标记反应，得到表面封闭的标记磁珠；其中L2与L1反应，Lable为想要标记到磁珠上的分子；/n当封闭基团MSK含有保护基PG时，所述保护基PG在标记反应之前或之后进行，得到最终用于电化学发光检测的标记磁珠；/n反应基团A选自以下反应基团的一种，包括氨基、羧基、羟基、炔基、叠氮基、卤代烷基、卤代芳基或磺酰基；/n当反应基团A为氨基时，具体步骤为：/n1）将羟基被保护基PG保护的羟基酸活化酯和带有反应基团X的酸的活化酯，与氨基磁珠表面的氨基通过成酰胺键反应，将氨基磁珠表面的氨基完全反应掉形成改性氨基磁珠（I）；/n2）将改性氨基磁珠（I）进行脱羟基保护基PG游离出羟基，得到表面是部分羟基和部分反应基团X的磁珠（II）；/n3）将被反应基团Y修饰的蛋白质分子链霉亲和素SA与磁珠表面的X基团进行标记反应得到用于电化学发光检测的磁珠；所述反应基团Y与反应基团X能够形成化学键。/n...

【技术特征摘要】
1.一种用于电化学发光检测的磁珠改性标记方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）将带有反应基团A的磁珠与化合物L1和封闭基团MSK先后或同时反应得处理后的磁珠；封闭基团MSK带有极性不带电的基团，含有保护基PG或不含保护基PG；
2）将带有与化合物L1反应的标记物L2-Lable与步骤1）处理后的磁珠进行标记反应，得到表面封闭的标记磁珠；其中L2与L1反应，Lable为想要标记到磁珠上的分子；
当封闭基团MSK含有保护基PG时，所述保护基PG在标记反应之前或之后进行，得到最终用于电化学发光检测的标记磁珠；
反应基团A选自以下反应基团的一种，包括氨基、羧基、羟基、炔基、叠氮基、卤代烷基、卤代芳基或磺酰基；
当反应基团A为氨基时，具体步骤为：
1）将羟基被保护基PG保护的羟基酸活化酯和带有反应基团X的酸的活化酯，与氨基磁珠表面的氨基通过成酰胺键反应，将氨基磁珠表面的氨基完全反应掉形成改性氨基磁珠（I）；
2）将改性氨基磁珠（I）进行脱羟基保护基PG游离出羟基，得到表面是部分羟基和部分反应基团X的磁珠（II）；
3）将被反应基团Y修饰的蛋白质分子链霉亲和素SA与磁珠表面的X基团进行标记反应得到用于电化学发光检测的磁珠；所述反应基团Y与反应基团X能够形成化学键。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述保护基PG是叔丁氧羰基、苄氧羰基、苄基、三氟甲酰基、苯甲酰基、芴氧羰基、烯丙氧羰基、甲氧羰基、乙氧羰基、乙酰基、特戊酰基、甲氧甲基或4,4'-二甲氧基三苯基甲基中任意一种。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中羟基被保护基PG保护的羟基酸活化酯和带有反应基团X的酸的活化酯中，羟基被保护基PG保护的羟基酸活化酯是...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨志伟，刘铮，胡春苗，
申请(专利权)人：江苏集萃分子工程研究院有限公司，苏州易莱生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32