一种酸改性水滑石负载脂肪酶的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种酸改性水滑石负载脂肪酶的制备方法，该方法采用乙酸和过氧化氢的混合物对镁铝水滑石进行改性，并将改性后的镁铝水滑石作为脂肪酶的载体，制备固定化脂肪酶。改性镁铝水滑石的表面形貌、晶型结构、结晶度等都发生了很大改变，有助于脂肪酶的负载，并且制备的固定化酶可以进行有效的回收利用，回收再利用的酶活性可到达原来的80％以上，具有很好的经济效益。

【技术实现步骤摘要】
一种酸改性水滑石负载脂肪酶的制备方法
本专利技术属于无机物改性利用领域，具体涉及一种酸改性水滑石负载脂肪酶的制备方法。
技术介绍
脂肪酶具有广泛的底物特异性和高对映选择性，在水解、合成反应中极具优越性，被广泛应用于医药、生物能源、食品、皮革、化工等领域。游离脂肪酶在工业应用中存在易结块、不可重复使用、难与产品分离、易失活等问题，相对于游离脂肪酶，固定化脂肪酶具有回收和再利用的可能性、操作简单和稳定性高等优势。目前，脂肪酶的固定技术有吸附法、共价法、交联法和包埋法，合成或天然聚合物、无机材料、纳米材料等都被用作酶固定化的载体。镁铝水滑石是一种具有纳米结构的阴离子型层状结构化合物，具有无毒、性价比高、热稳定性高等优点。但镁铝水滑石的比表面积、层间距等因素会影响脂肪酶的负载量，从而影响固定化酶的在工业生产中的应用。因此，为了负载更多的脂肪酶，需要对水滑石进行改性。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供了一种酸改性水滑石负载脂肪酶的制备方法。本专利技术方法得到的固定化脂肪酶回用率可达80％以上，本专利技术通过以下技术方案实现。一种酸改性水滑石负载脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：(1)将一定量乙酸和过氧化氢的混合物加入到镁铝水滑石中，在一定温度下，磁力搅拌反应一段时间，得到改性的镁铝水滑石。(2)将步骤(1)得到的改性产物进行离心洗酸，至上清液接近中性，然后真空干燥，干燥后研磨备用。(3)将步骤(2)中乙酸改性的镁铝水滑石作为载体，在一定温度下负载一段时间，得到固定化脂肪酶。(4)将步骤(3)得到的固定化脂肪酶进行离心洗涤，然后真空干燥，干燥后研磨备用。(5)采用PNP等暗点法测定步骤(4)中固定化脂肪酶的活性，并对固定化脂肪酶进行回用。将反应后的固定化脂肪酶进行洗涤、离心，再次测定其活性，回用后的固定化脂肪酶活性可达到原来的80％以上。优选地，步骤(1)所用改性试剂为乙酸和过氧化氢的混合物，乙酸与过氧化氢的体积比为1∶1-2。。优选地，步骤(1)中所述温度为50℃-70℃，反应时间为20-40min。优选地，步骤(2)中离心上清液pH约为7，在40-45℃的条件下进行真空干燥。优选地，步骤(3)中负载脂肪酶的温度为30-40℃，负载时间为6-16h。优选地，步骤(4)中固定化脂肪酶离心后的干燥条件：40-45℃真空干燥。优选地，步骤步骤(5)中固定化脂肪酶、PBS(pH＝8)、底物溶液的比例为1∶60∶20，孵育温度为37-40℃，时间为10-15min。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和有益效果：(1)本专利技术采用酸改性的镁铝水滑石作为负载脂肪酶的载体，改性方法简单，成本低，具有很好的经济效益。(2)本专利技术采用酸改性的镁铝水滑石作为负载脂肪酶的载体，有利于脂肪酶的重复利用，且得到的固定化脂肪酶回用后的酶活性可达到原来的80％以上。附图说明图1为本专利技术各实施案例的实验流程图。图2为实施例1原始镁铝水滑石水滑石和改性镁铝水滑石的SEM图。图3为实施例2原始镁铝水滑石水滑石和改性镁铝水滑石的XRD图。图4为实施例3固定化酶活性及回用活性柱状图。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术作进一步说明，但本专利技术要求保护的范围并不局限于此。实施例1步骤一：将4g镁铝水滑石放入1∶1的混合物(乙酸与过氧化氢)中，温度50℃，磁力搅拌反应20min，得到改性的镁铝水滑石载体。步骤二：将步骤一得到的改性镁铝水滑石载体进行离心洗酸，至上清液pH约为7，然后40℃真空干燥，干燥后研磨备用。步骤三：将步骤二中乙酸改性的镁铝水滑石作为载体，在30℃下负载6h，得到固定化脂肪酶。步骤四：将步骤三得到的固定化脂肪酶进行离心洗涤，然后40℃真空干燥，干燥后研磨备用。步骤五：将0.05g固定化酶和3mlPBS(pH＝8)缓冲溶液在37℃下孵育10min时间，然后加入1ml底物溶液启动反应，用紫外分光光度计测得347nm处的吸光度数值，通过公式计算出固定化酶的活性，并进行两次回用。如图2所示，左图SEM为未改性的镁铝水滑石，右图SEM为改性后的镁铝水滑石。从图中可以看出，镁铝水滑石的形貌发生了很大的改变，并且出现了明显的堆积聚集。实施例2步骤一：将4g镁铝水滑石放入1∶2的混合物(乙酸与过氧化氢)中，温度70℃，磁力搅拌反应40min，得到改性的镁铝水滑石载体。步骤二：将步骤一得到的改性镁铝水滑石载体进行离心洗酸，至上清液pH约为7，然后45℃真空干燥，干燥后研磨备用。步骤三：将步骤二中乙酸改性的镁铝水滑石作为载体，在40℃下负载6h，得到固定化脂肪酶。步骤四：将步骤三得到的固定化脂肪酶进行离心洗涤，然后45℃真空干燥，干燥后研磨备用。步骤五：将0.05g固定化酶和3mlPBS(pH＝8)缓冲溶液在40℃下孵育15min时间，然后加入1ml底物溶液启动反应，用紫外分光光度计测得347nm处的吸光度数值，通过公式计算出固定化酶的活性，并进行两次回用。如图3所示，从XRD图谱中可以看出，(003)(006)(012)(015)(018)均为镁铝水滑石的特征峰，改性后的镁铝水滑石的晶型结构、结晶度都发生了较大改变，说明乙酸和过氧化氢的混合物可以改变镁铝水滑石的结构。实施例3步骤一：将4g镁铝水滑石放入1∶1的混合物(乙酸与过氧化氢)中，温度60℃，磁力搅拌反应40min，得到改性的镁铝水滑石载体。步骤二：将步骤一得到的改性镁铝水滑石载体进行离心洗酸，至上清液pH约为7，然后40℃真空干燥，干燥后研磨备用。步骤三：将步骤二中乙酸改性的镁铝水滑石作为载体，在37℃下负载16h，得到固定化脂肪酶。步骤四：将步骤三得到的固定化脂肪酶进行离心洗涤，然后40℃真空干燥，干燥后研磨备用。步骤五：将0.05g固定化酶和3mlPBS(pH＝8)缓冲溶液在37℃下孵育15min时间，然后加入1ml底物溶液启动反应，用紫外分光光度计测得347nm处的吸光度数值，通过公式计算出固定化酶的活性，并进行两次回用。如图4所示，三次测得的固定化脂肪酶活性分别为928.75U/g、840.82U/g和714.04U/g，第二次和第三次固定化脂肪酶的回用率分别达到90.53％和84.92％。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酸改性水滑石负载脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)将一定量乙酸和过氧化氢的混合物加入到镁铝水滑石中，在一定温度下，充分混合并反应一段时间，得到改性镁铝水滑石。/n(2)将步骤(1)得到的改性产物进行离心洗酸，至上清液接近中性，然后干燥，干燥后研磨备用。/n(3)将步骤(2)中乙酸改性的镁铝水滑石作为载体，在一定温度下负载一段时间，得到固定化脂肪酶。/n(4)将步骤(3)得到的固定化脂肪酶进行洗涤，然后干燥，干燥后研磨备用。/n(5)采用PNP等暗点法测定步骤(4)中固定化脂肪酶的活性，并对固定化脂肪酶进行回用。将反应后的固定化脂肪酶进行离心洗涤、离心，再次测定其活性，回用后的固定化脂肪酶活性可达到原来的80％以上。/n

【技术特征摘要】
1.一种酸改性水滑石负载脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将一定量乙酸和过氧化氢的混合物加入到镁铝水滑石中，在一定温度下，充分混合并反应一段时间，得到改性镁铝水滑石。
(2)将步骤(1)得到的改性产物进行离心洗酸，至上清液接近中性，然后干燥，干燥后研磨备用。
(3)将步骤(2)中乙酸改性的镁铝水滑石作为载体，在一定温度下负载一段时间，得到固定化脂肪酶。
(4)将步骤(3)得到的固定化脂肪酶进行洗涤，然后干燥，干燥后研磨备用。
(5)采用PNP等暗点法测定步骤(4)中固定化脂肪酶的活性，并对固定化脂肪酶进行回用。将反应后的固定化脂肪酶进行离心洗涤、离心，再次测定其活性，回用后的固定化脂肪酶活性可达到原来的80％以上。


2.根据权利要求1所述的一种酸改性水滑石负载脂肪酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中采用乙酸和过氧化氢对水滑石进行改性。


3.根据权利要求1所述的一种酸改...

【专利技术属性】
技术研发人员：许桂红，刘海生，王柱，张宇翔，李兴华，
申请(专利权)人：广东省造纸研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44