一种具有细胞选择性的抗体修饰ZIF-8纳米材料及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种具有细胞选择性的抗体修饰ZIF‑8纳米材料，所述抗体修饰ZIF‑8纳米材料以沸石咪唑酸酯骨架8为载体，将蛋白包封在载体中，再在包封蛋白的载体表面吸附抗体制备而成，达到细胞选择性递送蛋白的目的。该材料制备方法简单，条件温和，细胞选择性高，递送蛋白效率提高，并保持了蛋白的生物活性，可进一步应用于疾病的精准治疗，在临床治疗方面具有应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种具有细胞选择性的抗体修饰ZIF-8纳米材料及其制备方法与应用(一)
本专利技术涉及一种具有细胞选择性的抗体修饰ZIF-8纳米材料及其制备方法与应用。(二)
技术介绍
现有技术中，利用蛋白质进行疾病治疗也越来越普遍，但由于蛋白质细胞低渗透性、存放条件苛刻，为了保证蛋白质的生理和生化性能，常常需要使用载体。其中已报道的沸石咪唑酸酯骨架8(ZIF-8)，以锌离子配位甲基咪唑形成的一种金属-有机框架(MOFs)，具有高比表面积、高空隙率、高稳定性，是一种优异的高效包封蛋白质的纳米载体。最近报道ZIF-8在有效递送蛋白质的同时，也能对细胞中pH响应，从而增强其溶酶体逃逸能力，促进蛋白质的有效释放。然而，尚未开发出精准靶向癌细胞的ZIF-8材料。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种具有细胞选择性的抗体修饰的ZIF-8纳米材料及其制备方法与应用，以沸石咪唑酸酯骨架8(ZIF-8)为载体包封蛋白，再通过吸附作用将抗体吸附到载体的表面，最终获得了具有细胞选择性的抗体修饰的ZIF-8纳米材料，用作蛋白递送载体。通过实例验证了该材料能够靶向特定的细胞进行蛋白递送，并利用递送蛋白的特性达到细胞毒性或基因编辑目的。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种具有细胞选择性的抗体修饰ZIF-8纳米材料，所述抗体修饰ZIF-8纳米材料以沸石咪唑酸酯骨架8(ZIF-8)为载体，将蛋白包封在载体中(记为蛋白@ZIF-8)，再在包封蛋白的载体表面吸附抗体制备而成(记为抗体@蛋白@ZIF-8)，达到细胞选择性递送蛋白的目的。所述抗体通过电荷吸附到包封蛋白的载体的表面，所述抗体的选择主要以靶向细胞外膜上的过表达抗原为靶点，包括特异性靶向细胞外膜上的过表达抗原EGFR的西妥昔单抗(Cetuximab，Cet)。所述蛋白包括牛血清蛋白(BSA)、核糖核酸酶A(RNaseA)或Cas9/sgRNA，但不仅仅局限于以上三种蛋白。其中Cas9蛋白选用氮末端含有一段核定位序列，所述核定位序列可以靶向细胞核并进行基因编辑，优选为Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val；优选Cas9通过表达质粒(pET-NLS-Cas9-6xHis，购于AddgeneCat：62934)(参考以下文献表达蛋白J.A.Zuris,D.B.Thompson,Y.Shu,J.P.Guilinger,J.L.Bessen,J.H.Hu,M.L.Maeder,J.K.Joung,Z.Y.ChenandD.R.Liu,Nat.Biotechnol.,2015,33,73-80.)制备，sgRNA以XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU模板定制，其中20个X碱基根据目的基因和CRISRP剪切条件设计，优选为CACGCCCGAUACGCUGAGUG。优选靶向GPX4的sgRNA(CACGCCCGAUACGCUGAGUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU。将Cas9与sgRNA按物质的量之比为1：1混合，获得Cas9/sgRNA。本专利技术所述抗体修饰ZIF-8纳米材料按如下方法制备：(1)包封蛋白的载体：在搅拌(优选390rpm)下，将蛋白添加到2-甲基咪唑(2-MIM)水溶液中，并在30℃下搅拌10分钟；滴加硝酸锌六水合物水溶液，在30℃下搅拌1小时，在6000rpm下离心10分钟，得到固体沉淀，用去离子水洗涤3次，即得到所述包封蛋白的载体溶液(优选以2mg/mL浓度保存在去离子水中)。所述蛋白与硝酸锌六水合物水溶液中硝酸锌六水合物质量比为1：7.4，所述蛋白与2-甲基咪唑的质量比为1：300～520。所述2-甲基咪唑(2-MIM)水溶液浓度为4.5mol/L，所述硝酸锌六水合物水溶液浓度为0.45mol/L；所述蛋白添加量以含有2-甲基咪唑和硝酸锌六水合物的水溶液总体积计为0.5mg/mL。(2)抗体修饰ZIF-8纳米材料：包封蛋白的载体溶液中，缓慢加入抗体溶液，在4℃下持续搅拌孵育2小时，得到抗体修饰ZIF-8纳米材料。所述包封蛋白的载体溶液浓度为2mg/mL；所述抗体溶液中抗体与包封蛋白的载体溶液中包封蛋白的载体质量比为1：80。本专利技术所述抗体利用AmershamTMQuickstain试剂盒进行了Cy5荧光基团标记，以实现细胞内的可视化观察，制备方法：取5mg/mL的抗体溶液于500mMNaHCO3水溶液中，然后加入Cy5-NHS(50mM，购自Amersham)，在4℃下反应3小时后，加入PBS溶液(pH7.4)，随后用微型离心柱(SpinColumns，7KMWCO，cat89882，ThermoScientificTM)离心(1500G，2min)，收集溶液，得到修饰的抗体溶液；所述抗体溶液与NaHCO3水溶液体积比为1:4，所述抗体溶液与Cy5-NHS体积比为1:0.05。本专利技术还提供一种所述抗体修饰ZIF-8纳米材料在细胞选择性递送蛋白中的应用。所述细胞包括过表达EGFR的细胞系，更优选人皮肤鳞癌细胞A431。与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：本专利技术以ZIF-8材料为载体包裹蛋白，通过物理吸附作用，将抗体修饰在载体表面，具有以下优点：1)该材料制备方法简单，条件温和，细胞选择性高，递送蛋白效率提高，并保持了蛋白的生物活性，可进一步应用于疾病的精准治疗，在临床治疗方面具有应用价值。2)该材料的组装可任意改变装载蛋白，如实例中的BSA、RNaseA和CRISPR/Cas9系统，材料具有普适性。3)该材料的组装可改变表面抗体，从而实现不同的靶向性；3)该材料对pH敏感，在pH<7的条件下，锌离子与咪唑基团的配位键断开，将包裹蛋白的释放。5)因外表面的抗体特异性，该材料能够特异性靶向相应抗原过表达的细胞系，比如西妥昔单抗特异性靶向过表达EGFR的A431细胞系，从而更进一步达到精准治疗。(四)附图说明图1为抗体@CC@ZIF-8纳米材料用于细胞选择性递送蛋白原理图。图2为实施例2合成的FBSA@ZIF-8纳米材料的TEM表征图。a为FBSA@ZIF-8；b为Cet@FBSA@ZIF-8；c为IgG@FBSA@ZIF-8。图3为Cet@FBSA@ZIF-8在不同pH下的体外释放图。图4为不同浓度的BSA@ZIF-8对人皮肤鳞癌细胞A431的细胞活度图。图5为不同浓度的BSA@ZIF-8对人宫颈癌细胞HeLa的细胞活度图。图6为IgG@FBSA@ZIF-8(A)和Cet@FBSA@ZIF-8(B)在人皮肤鳞癌细胞A431中的荧光共聚焦显微镜成像图。BR表示明场下拍的细胞图；FITC表示在488nm激发，520nm发射下收集的荧光信号；Cy5表示在638nm激发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有细胞选择性的抗体修饰ZIF-8纳米材料，其特征在于所述抗体修饰ZIF-8纳米材料以沸石咪唑酸酯骨架8为载体，将蛋白包封在载体中，再在包封蛋白的载体表面吸附抗体制备而成；所述抗体以细胞外膜上的过表达抗原为靶点；所述沸石咪唑酸酯骨架8记为ZIF-8。/n

【技术特征摘要】
1.一种具有细胞选择性的抗体修饰ZIF-8纳米材料，其特征在于所述抗体修饰ZIF-8纳米材料以沸石咪唑酸酯骨架8为载体，将蛋白包封在载体中，再在包封蛋白的载体表面吸附抗体制备而成；所述抗体以细胞外膜上的过表达抗原为靶点；所述沸石咪唑酸酯骨架8记为ZIF-8。


2.如权利要求1所述的抗体修饰ZIF-8纳米材料，其特征在于所述抗体包括西妥昔单抗。


3.如权利要求1所述的抗体修饰ZIF-8纳米材料，其特征在于所述蛋白包括牛血清蛋白、核糖核酸酶A或Cas9/sgRNA。


4.一种权利要求1所述抗体修饰ZIF-8纳米材料的制备方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：(1)包封蛋白的载体：在搅拌下，将蛋白添加到2-甲基咪唑水溶液中，并在30℃下搅拌10分钟；滴加硝酸锌六水合物水溶液，在30℃下搅拌1小时，在6000rpm下离心10分钟，得到固体沉淀，用去离子水洗涤3次，并用去离子水悬浮，即得到所述包封蛋白的载体溶液；
(2)抗体修饰ZIF-8纳米...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛璟燕，刘健，蒋林冶，袁超男，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33