一种益生菌体系的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种益生菌体系的制备方法，通过使用该方法能够获得一种稳定的外源性益生菌体系，该益生菌体系经服用后可在宿主内形成稳定的微环境，能够起到改变肠道微生物群组成的效果，最终在恶性肿瘤治疗过程中发挥积极作用。

【技术实现步骤摘要】
一种益生菌体系的制备方法及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及益生菌体系的制备方法，特别涉及可用于恶性肿瘤治疗的益生菌体系的制备方法。
技术介绍
益生菌是通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。主要有乳酸菌、双歧杆菌，放线菌，酵母菌等。它们通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或通过调节肠道内菌群平衡，促进营养吸收保持肠道健康的作用。益生菌对人体通常被认为具备多种益处，包括：提高机体免疫力、维持肠道菌群结构平衡、提高机体抗氧化水平、抑制肠道炎症、保护肠道粘膜屏障。已有一些报道指出，肠道益生菌也对肿瘤生长具有抑制作用，对恶性肿瘤的治疗具有明显效果。例如，根据Gopalakrishnan等人于2018年的研究，益生菌的抗肿瘤功效与免疫激活有关。肿瘤患者肠道菌群异于健康人群，在健康人群中双歧杆菌为优势菌群，但在部分患癌人群中双歧杆菌显著减少。双歧杆菌(Bifidobacterium)是一种革兰氏阳性、杆状、端部有时呈分叉状的厌氧益生菌，其广泛存在于人和动物的消化道、阴道和口腔内。双歧杆菌能够与人体免疫细胞互相作用，调节先天性及适应性免疫相关的特定信号通路，促进Th1型免疫反应。双歧杆菌具有增强肿瘤微环境中的树突细胞的功能及CD8+T细胞的招募。另一方面，由于恶性肿瘤患者会接受各类治疗，这些治疗手段对微生物群的组成也会产生巨大影响。因此，帮助恶性肿瘤患者重建、优化其肠道菌群结构是具有积极意义的。然而，为了重塑肠道微生物群，让益生菌在人体内产生积极效果，需要改变肠道微生物群的组成。目前已报道的改变肠道微生物群组成的方法主要是，粪便微生物移植(fecalmicrobialtransplantation)以及服用益生菌。粪便微生物移植成本高、操作复杂，还存在较大的病原体感染风险，因此并不是一项优选的治疗方案。同时，目前的各类实践与尝试均表明，直接口服益生菌的效果微乎其微，服用益生菌仅能在短时间内临时性地改变肠道微生物群组成，这个时间短到这些益生菌无法发挥功效。造成这种现象的原因在于，外源细菌在宿主肠道中的栖息能力很差，无法形成稳定的聚集和自我保护体系，因此非常容易被胃肠环境直接清除。因此，本专利技术希望专利技术一种方法，通过该方法能够获得一种外源性稳定的益生菌体系，该体系能够在宿主内形成稳定的微环境，能够通过类似口服这样的简单方式进行施用，能够起到改变肠道微生物群组成的效果，最终在恶性肿瘤治疗过程中发挥积极作用。
技术实现思路
为了解决
技术介绍
中提到的问题，专利技术人创造性地提出了利用无机材料体系与益生菌制备一种能够在宿主体内形成长期稳定菌群的方法。本专利技术公开了一种制备益生菌体系的方法，所述方法主要在于将益生菌与无机材料共同培养，最终形成稳定的益生菌体系。在制备时，应将处于稳定生长期的益生菌，与经过无菌处理过的无机材料混合培养一段时间，待该益生菌体系稳定时即可进行分离纯化，获得所需要的益生菌体系。本专利技术公开的制备方法所需要用的原料包括益生菌和无机材料。其中，益生菌可以是单一菌种，也可以是混合菌种；无机材料可以是天然矿物材料，也可以是经加工的天然材料，还可以是人工制备的材料。优选地，用于制备益生菌体系的益生菌是在生长繁殖过程中能产生酸性环境的益生菌，此处所述能产生酸性环境的益生菌指的是益生菌在新陈代谢过程中在菌落周围形成酸性环境。更优选地，用于制备益生菌体系的益生菌是乳酸菌。最优选地，用于制备益生菌体系的益生菌是乳杆菌，双歧杆菌，丁酸梭菌或粪肠球菌中的一种或几种。优选地，用于制备益生菌体系的无机材料是具有阳离子交换能力和高表面积的材料，这些材料应具有一定的粒径，该粒径与其混合培养的益生菌菌体大小处于同一数量级。无机材料的粒径控制在5～100微米范围较为合适。优选地，用于制备益生菌体系的无机材料可选自各类具有微孔结构的阳离子交换树脂，萤石，双八面体蒙脱石(DioctahedralSmectites)亚族中的任一种，例如贝得石(Beidellite)、蒙脱石(Montmorillonite)、绿脱石(Nontronite)；三八面体蒙脱石(TrioctahedralSmectites)亚族中的任一种，例如皂石(Saponite)、锌蒙脱石(Sauconite)、水辉石(Hectorite)、斯蒂文石(Stevensite)；硅藻土，高岭土，凹凸棒土，伊利石，绿泥石，海泡石，沸石，滑石。更优选地，用于制备益生菌体系的无机材料是在酸性环境中表面带正电荷的材料。最优选地，用于制备益生菌体系的无机材料是在中性或碱性环境中表面不带正电荷，而在酸性环境中表面带正电荷的材料。人工材料可以是介孔二氧化硅，孔径在2-50nm；或者是金属有机骨架化合物，所述金属有机骨架化合物选择ZIF-67，UiO-66(Zr)，MOF-74-Mg，Co-MOF-74，MIL-53(Fe)，MIL-101，MOF-74-Ni，Cu-BTC，MOF-74-Fe，ZIF-8(BasoliteZ1200)，RMOF-1，MIL-100(Cr)，MOF-5，Ce-BTC，MgDOBDC，MIL-53(Al)中的某一种。在一些实施例中，用于制备益生菌体系的无机材料选择了来自蒙皂石(smectite)族天然的或者经过一定人工处理的，矿物材料。更具体地说，选择了来自蒙脱石(montmorillonite)亚族的，天然的或者经过一定人工处理的，矿物材料。在其他一些实施例中，用于制备益生菌体系的无机材料还选择了硅藻土、高岭土或凹凸棒土中的一种。在其他一些实施例中，用于制备益生菌体系的无机材料还选择了人工制备的，在酸性环境中表面带正电荷的材料。本专利技术公开的制备方法如下所述：步骤1：将益生菌菌株于25-40℃，0-200rpm条件下厌氧培养，直至cfu在2×104～2×109之间；步骤2：将无菌的无机材料在等渗缓冲液中搅拌10min-1h，形成的无机材料悬液的浓度在0.001-0.1g/ml之间；步骤3：将步骤1中的益生菌菌液与步骤2中的无机材料悬液以10：1-1：10的体积比例混合，25-40℃，0-200rpm条件下厌氧培养4h-96h；步骤4：成品分离并纯化后冻干并保存于四度。其中，步骤2中提到的无机材料的灭菌过程可以采用现有常见的灭菌技术，例如：消毒剂(乙醇)浸泡；紫外线照射，辐照等。其中，步骤2中陶的等渗缓冲液可以是：磷酸盐缓冲液(PBS)、生理盐水或TBS等。其中，步骤4中分离的方法可以采用现有常见的分离技术，例如：过滤；离心；冻干等。其中，步骤4中纯化的方法可以采用现有常见的纯化技术，例如：透析；梯度离心等。为了后期施用的方便，为施用方式提供多种选择，可以通过采用不同的纯化技术来使该方法制备出来的益生菌体系具备多种形态，例如为可冲泡的固体形态、可咀嚼的固体形态、可注射的注射液、可口服的口服液和可吸入的气态中的一种。通过实验证明，采用本专利技术公开的制备方法获得的益生菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种益生菌体系的制备方法，其特征在于，所述方法包括：/n步骤1：将益生菌与无菌的无机材料混合后进行厌氧培养；/n步骤2：分离纯化。/n

【技术特征摘要】
20191216 CN 20191128995671.一种益生菌体系的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤1：将益生菌与无菌的无机材料混合后进行厌氧培养；
步骤2：分离纯化。


2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤1之前进行益生菌活化，即将益生菌在25-40℃，0-200rpm条件下厌氧培养。


3.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1之前进行无机材料活化，即将无菌的无机材料在等渗缓冲液中搅拌10min-1h，形成无机材料悬液，其中等渗缓冲液为：磷酸盐缓冲液(PBS)、生理盐水和TBS中的至少一种。


4.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的具体做法为：将浓度为0.001-0.1g/ml的无机材料悬液与cfu为2×104～2×109的益生菌菌液以体积比为10：1-1：10的比例混合，在25-40℃，0-200rpm条件下厌氧培养4h-96h。


5.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述分离纯化采用：过滤、离心、冻干、透析和梯度离心中的至少一种。


6.权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，所述益生菌为在生长繁殖过程中能产生酸性环境的益生菌。


7.权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述益生菌为乳酸菌(lacticacidbacteria)。


8.权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述益生菌选自乳杆菌、双歧杆菌、丁酸梭菌和粪肠球菌中的一种或几种。


9.权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，所述无机材料是具有阳离子交换能力和高表面积的材料，且具有5-100微米的粒径。


10.权利要求9所述的益生菌体系，其特征在于，所述无机材料是在酸性环境中，表面带正电荷的材料。


11.权利要求10所述的益生菌体系，其特征在于，所述无机材料是人工制备的，在酸性环境中表面带正电荷的材料。


12.权利要求11所述的益生菌体系，其特征在于，所述无机材料是具有微孔结构的阳离子交换树脂、萤石、双八面体蒙脱石(DioctahedralSmectites)亚族、三八面体蒙脱...

【专利技术属性】
技术研发人员：董磊，韩丛薇，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32