用于肾脏移植后BK病毒性肾病风险分层的方法技术

本申请描述并要求保护一种新的方法，其用于鉴定和分层经过肾脏移植的患者中发生BK病毒肾病(以下称为“Nx BK‑v”)的风险。该方法使用至少三个生物标记物的指数组合：i)抗BK‑v记忆T淋巴细胞(BK‑v特异性记忆T淋巴细胞，以下称为“抗‑BK‑v LTm”)应答的强度，ii)移植供体和受体之间I类和II类HLA等位基因中发生不相容性的数量，还考虑iii)患者全血中的BK‑v病毒的病毒载量。本发明专利技术的方法允许非常精确地评估在测试后的数月期间发生Nx BK‑v的风险，以优化免疫抑制治疗，并更好地保留移植的肾脏。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于肾脏移植后BK病毒性肾病风险分层的方法
技术实现思路
本专利技术描述并要求保护一种在肾脏移植患者中鉴定和分层发生BK病毒性肾病(以下称为“NxBK-v”)的风险的新方法。该方法使用组合至少三种生物标记物的指数：i)抗BK-v记忆T细胞应答的强度(对BK-v特异性记忆T细胞，以下称为“抗BK-vLTm”)，ii)移植物供体和受体之间I类和II类HLA等位基因不相容性的数量；考虑到iii)患者血液中的BK-v病毒载量。本专利技术的方法能够在测试后一个月内非常精确地评估发生NxBK-v的风险，以优化免疫抑制治疗以更好地保存移植的肾脏。现有技术在本申请中使用以下缩写：-BK-v：人BK多瘤病毒(Polyomavirus)；-CFSE：羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，一种淋巴细胞增殖标记物；-HLA：人白细胞抗原；-JC-v：人JC多瘤病毒；-抗BK-vLTm：BK-v特异性记忆T细胞；-NxBK-v：BK病毒性肾病；-抗BK-vLTm应答：BK-v特异性记忆T细胞应答。终末期慢性肾脏疾病及其替代疗法终末期慢性肾脏疾病是肾脏功能的彻底和确定性损伤，需要使用肾脏替代治疗(通过透析或移植)。在法国，2015年终末期慢性肾脏疾病的患病率为82295名患者，或每百万居民中有1232名。肾脏移植目前是终末期慢性肾脏疾病最有效的治疗方法。与维持透析相比，肾脏移植可提高患者的生存率和生活质量，并降低经济成本。它是全球最大的实体器官移植行为。2014年，全球器官捐赠和移植组织(GODT，世界卫生组织中的结构)记录了全球119873名移植患者，其中包括79948名(67％)肾脏移植患者。在法国，2015年估计功能性肾脏移植的患者人数为36729，或每百万居民中552.4例的患病率，因此占终末期慢性肾脏疾病治疗的82295例患者的44.6％。由于目前器官短缺，无法满足所有肾脏移植的需求(1个肾脏移植物可供4.7位等待肾脏的人，中位数等待时间为18.5个月)，因此必须延长肾脏移植物的寿命，目前估计为13年([1]、[2])。为此，移植患者通常接受免疫抑制疗法。该措施实际上是控制同种异体免疫应答和增加移植物存活必不可少的。但是，治疗性免疫抑制可能与并发症相关，尤其是传染性并发症，可能对移植物有害。这些感染可能导致移植肾的丢失，因此要求患者重新透析(以及产生的所有有害后果)，并使得等待肾脏移植物的患者人数增加。肾脏移植中BK和JC多瘤病毒的再激活病毒再激活是免疫低下患者中非常常见的并发症。特别地，某些多瘤病毒的再激活是特别令人关注的。在人中，目前存在13种已知的多瘤病毒种。它是一种非常常见的病毒，以种属特异性感染许多动物物种。这些病毒感染的血清阳性率在全球范围内很高(成年时为80-90％)，表明病毒的早期和广泛暴露。两个主要代表是BK病毒(BK-v)和JC病毒(JC-v)。这些病毒的共同特征是它们能够在无症状的情况下长期在体内存活，并在免疫抑制的情况下成为病原体([3]、[4])。移植后，已知BK-v会感染尿道的上皮细胞和移植肾的肾实质。在肾脏移植患者中，BK病毒的再激活可以导致血液中可检测到的病毒载量(>200拷贝/mL)。因此，在肾脏移植的背景下，BK-v引起肾病(以下称为NxBK-v)、肾衰竭或输尿管狭窄([4])。在造血干细胞移植的背景下，BK-v引起出血性膀胱炎([4])。在肾脏移植患者中观察到几种水平的BK-v再激活(图1)。患者可能出现：-1-“BK-v病毒尿症”，无可检测的病毒血症或肾脏受累。在这些患者中，BK-v在尿路中复制。在近40％的肾脏移植患者中观察到病毒尿症，并且通常发生在移植后的前3至6个月。-2-“独立的BK-v病毒血症”，在肾脏移植物中未检测到特异性肾脏损害。在近24％的肾脏移植患者中观察到这种病毒血症，并且通常发生在肾脏移植后的前12个月。-3-NxBK-v。在这些患者中，除了病毒血症和病毒尿症外，还在肾脏移植物中观察到病毒复制，造成特定肾脏损害。目前的组织学诊断显示核病毒包涵体(SV40T阳性抗原)、核营养不良、多态性细胞浸润和肾纤维化。在近10％的肾脏移植患者中诊断出这种严重并发症，并且通常发生在肾脏移植后的前24个月。([5]-[6])。NxBK-v的进展取决于肾实质损害的程度，其本身与病毒载量的强度相关(见表8，Hirsch等人，2014[7])。在免疫系统成功控制实质内BK-v复制的患者中，结果是有利的。作为回报，持续强度和长时间的BK-v实质内病毒复制对肾实质造成不可逆转的损害，导致慢性功能障碍、肾脏疾病，并最终在超过50％的病例中导致丧失移植物。Hirsch等人，ClinicalMicrobiologyandInfection2014[7]的表8显示了NxBK-v的不同组织学阶段，以及与组织学损伤相关的肾脏预后。图2显示了在有或没有NxBK-v的患者中，移植后3年的肾功能评估(通过测量肾小球滤过率-a部分)和肾脏移植物的存活率(b部分)。这些数据来自产生本专利技术的研究组。本专利技术人于2014年11月至2017年11月在94名肾脏移植患者的群体中进行这项观察性(非干预性研究)研究，根据其BK-v激活程度将患者分为4组：一组无BK-v再激活(n＝25)；一组具有独立的BK-v病毒尿症(n＝25)；一组具有独立的BK-v病毒血症，无组织学证明的NxBK-v(n＝22)；一组具有组织学证明的NxBK-v(n＝22)。图2显示NxBK-v患者患有严重的肾脏移植物功能障碍。一旦诊断出NxBK-v，就会出现这种功能障碍，并逐渐恶化，随访3年后有50％的病例失去移植物。因此，有必要在肾脏移植患者中早期检测NxBK-v，甚至对其进行预期，以更好地尝试终止它。NxBK-v的风险因子、以及当前的诊断和治疗方法已知BK-v的复制受不同因子的促进，包括免疫抑制治疗的性质和强度以及对BK-v特异性免疫应答的损伤([8])。更确切地说，发生NxBK-v的风险与免疫抑制治疗(他克莫司-霉酚酸酯的组合(目前肾脏移植的标准治疗方法))的强度以及大量累积的对皮质类固醇的暴露(在BK-v病毒血症之前6个月内>3000mg皮质类固醇)显著相关。还确定了与免疫抑制治疗不相关的其他风险因子，例如供体和受体的年龄、受体的性别或对移植物特异的特征(例如缺血再灌注损伤)([7])。当前，没有针对该病毒的特异性抗病毒疗法。诸如西多福韦的治疗导致对肾脏移植物显著的毒性，在严重的移植物功能障碍的情况下禁用。此外，已证明来氟米特或氟喹诺酮在独立的病例中有效。但是，该不一致的疗效和这些稀少病例的不足的数量，目前不允许在常规实践中推荐使用这些药物分子[24])。目前唯一公认的对NxBK-v的治疗是减少对移植物受体进行的治疗性免疫抑制([7]、[24])。实际上，当通过免疫抑制治疗降低免疫系统的活性时，就会发生BK-v病毒的再激活。当检测到NxBK-v时，第一疗法反应是减少免疫抑制。但是，这本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种评估肾脏移植的患者中发生BK病毒(BK-v)肾病的风险的方法，所述方法包括以下步骤：/na)测量所述患者的生物样本中BK-v的病毒载量，/nb)测量来自所述患者的生物样本中BK-v病毒特异性CD4

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180618 FR 18553421.一种评估肾脏移植的患者中发生BK病毒(BK-v)肾病的风险的方法，所述方法包括以下步骤：
a)测量所述患者的生物样本中BK-v的病毒载量，
b)测量来自所述患者的生物样本中BK-v病毒特异性CD4+或CD8+记忆T细胞应答的归一化强度，所述归一化是相对于步骤a)中测量的BK-v病毒载量进行的，和
c)确定肾脏供体与所述患者的HLAI和II之间的不相容性的数量。


2.根据权利要求1所述的方法，其中然后汇编三个参数a)、b)和c)，以创建患者将发生BK病毒肾病的风险分层指数。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤a)中通过对来自所述患者的全血或血浆样本进行定量PCR来测量BK-v病毒载量。


4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中通过以下确定步骤b)中测量的BK-v特异性CD4+或CD8+记忆T细胞的应答：使所述患者的外周血单个核细胞与BK-v病毒肽接触、以及在培养4至7天后，通常在培养5天后，评估存在于所述单个核细胞中的T细胞的增殖。


5.根据权利要求4所述的方法，其中在所述肽存在时，通过培养4至7天后，通常在培养5天后，确定具有稀释的增殖标记物例的CD4+T细胞的比例，来测量所述增殖；例如，所述增殖标记物是CFSE。


6.根据权利要求4所述的方法，其中在所述肽存在时，通过培养4至7天后，通常在培养5天后，确定具有稀释的增殖标记物例的CD8+T细胞的比例，来测量所述增殖；例如，所述增殖标记物是CFSE。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在以下情况下得出发生BK病毒(BK-v)肾病的风险高的结论：
a)与每mL血液中103拷贝BK-v病毒的病毒载量相关，
b)B...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y·陶菲克，A·杜巴克，M·德凯泽，
申请(专利权)人：巴黎萨克雷大学，国家健康科学研究所，法国公立援助医院，
类型：发明
国别省市：法国;FR