一种结直肠癌基因突变位点的检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术提供一种结直肠癌基因突变位点的检测方法及其试剂盒，所述检测方法包括：首先，制备得到数字PCR混合液，所述数字PCR混合液不包含三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸，所述数字PCR使用的引物包含三维结构，所述数字PCR使用的引物包含不少于十二个碱基的核酸序列N；其次，用数字PCR混合液进行PCR扩增反应，得到PCR扩增反应后的产物；最后，根据荧光信号的类型判断待测样品中是否含有目标基因的位点突变的DNA模板及其数量和突变风度。本发明专利技术独特的超多重数字PCR技术大幅提高了肿瘤基因检测的信息通量，可以在4个反应体系内扩增多达140重位点，避免了由于样本分管造成的灵敏度降低的问题，同时检测位点数的提升使检测的临床意义大幅提升。提升。提升。

【技术实现步骤摘要】
一种结直肠癌基因突变位点的检测方法及其试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种结直肠癌基因突变位点的检测方法及其试剂盒。

技术介绍

[0002]作为EGFR下游的信号分子，KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF是众多信号通路上关键的激活因子。这些基因的突变常见于多种恶性肿瘤，在结直肠癌患者中的突变率分别为20～50％、1～6％、10～30％、8～15％。KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突变一般会使结直肠癌患者对抗EGFR抗体类药物产生耐药。因此，检测这些基因突变情况有助于患者选择有效的临床治疗方案。相比二代测序技术，PCR技术有着快速、低成本、简便得优势。但是，传统的PCR技术手段容易产生非特异性扩增。为了避免非特异性扩增对结果信噪比和特异性的影响，PCR体系内扩增重数通常被限制在10重以内。又由于目前临床上需要检测的肿瘤突变位点有近千个，因此目前结直肠癌的基因检测几乎以NGS平台为主。目前基于PCR的肿瘤基因检测产品由于扩增重数的限制，仅覆盖少量位点，而且需要在多个反应体系内完成(艾德生物使用了12个反应本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种结直肠癌基因突变位点的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：步骤一、制备得到数字PCR混合液；其中，所述数字PCR混合液不包含三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸，所述数字PCR混合液使用的引物包含以下碱基组成：ACTCATCTGTGAGACTCACTATAGGAAGAGATGTCAACTCGTGCACGAGTTGACATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATATTGGAGGAAGCTCGAGCTGGAGGAAAAGTGAGTCTCACAGATGAGT；步骤二、用数字PCR混合液制作PCR微反应单元，再进行数字PCR扩增反应，得到数字PCR扩增反应后的产物；其中，所述数字PCR扩增反应可在至少4个反应体系中扩增至少140重位点步骤三、对所述PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号的类型判断待测样品中是否含有目标基因的位点突变的DNA模板及其数量和含量。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，对所述数字PCR混合液使用的引物进行预处理，所述预处理方法包括：将所述数字PCR混合液使用的引物加入到缓冲液中加热至70~85℃，保温7~10分钟，然后冷却至20~40℃，保温20~30分钟。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：尚午，张毅良，曹跃鹏，
申请(专利权)人：南京普济生物有限公司，
类型：发明
国别省市：