评估CAR功能性的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于评估嵌合抗原受体(CAR)表达细胞的功能性的方法。更具体地，该方法基于胞啃作用过程，其涉及抗原表达靶细胞和抗原特异性免疫细胞之间的膜转移。抗原特异性免疫细胞之间的膜转移。抗原特异性免疫细胞之间的膜转移。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】评估CAR功能性的方法


[0001]本专利技术涉及免疫学、细胞生物学和分子生物学领域。在某些方面，本专利技术的领域涉及免疫疗法。更具体地，本专利技术涉及用于确定嵌合抗原受体(CAR)特征例如特异性、功能性和灵敏性的方法。

技术介绍

[0002]多年来，癌症治疗的基础是手术、化学疗法和放射疗法。但是，在过去的几年中，免疫疗法已成为癌症治疗的有效工具。
[0003]基因工程的进步导致了合成的肿瘤靶向受体(称为嵌合抗原受体(CAR))的设计，该受体可以被引入到人免疫细胞(例如T细胞)中，以重定向抗原特异性并增强效应免疫细胞的功能。CAR最早是在1980年代中期开发的，此后人们对这些受体的兴趣不断增长。它们首先被产生以通过独立于HLA
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肽复合物提供特异性抗原识别而绕过表达T细胞的固有的TCR特异性。Eshhar及其同事在1993年的一项研究中首次描述了原型单链CAR，其中T细胞的特异性活化和靶向分别是通过由靶抗原特异性抗体结构域和Fcε受体或T细胞受体CD3复合物的γ或ζ信号传导亚基组成的分子介导的(Eshhar等人,1993,Proc Natl Acad Sci.,90,720
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4)。从那时起，许多研究小组设计出了具有单一肿瘤定向特异性和增强的信号传导胞内结构域的CAR分子。如今，CAR的结合结构域通常由单链抗体(scFv)的抗原结合结构域或选自文库并包含通过柔性接头连接的单克隆抗体(Mab)的轻链和重链可变片段的抗体结合片段(Fab)组成。scFv保留与衍生其的完整抗体相同的特异性和相似的亲和力，并且能够特异性结合至感兴趣的靶标。因此，CAR在单个融合分子中结合了抗原特异性和T细胞活化特性。实际上，scFv连接至包含CD3ζ的细胞内信号传导模块，以在抗原结合后诱导T细胞活化。模块结构已从仅具有CD3ζ信号传导结构域的第一代CAR扩展到将诸如CD28、4
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1BB或OX40的信号传导胞内结构域连接至CD3ζ的第二代和第三代CAR，以试图模拟共刺激。
[0004]CAR允许将T细胞以MHC非依赖性机制针对癌症进行靶向。CAR的配体结合与TCR对肽/MHC(pMHC)的结合在受体亲和力、抗原密度和空间特性上不同；并且设计针对特定靶分子的最佳CAR的实验方法依赖于体外或人肿瘤异种移植模型中转导的T细胞的功能测定。正如通过TCR/pMHC识别观察到的那样，由于CAR不太可能连续地与靶分子结合并聚集在有组织的突触中，因此可以认为，与TCR相比，CAR识别需要更高的配体密度。除了亲和力和特异性之外，这些受体的最佳构型和应用还依赖于构建体设计、信号传导结构域、载体递送系统、受体免疫细胞群和制造。
[0005]特别地，CAR有效性部分取决于CAR本身的亲和力，而另一部分则取决于胞外结构域(ectodomain)的组分。scFv中柔性接头序列的存在以及胞外结构域与胞内结构域之间的连接类型(铰链和跨膜区域)可以通过修饰(i)所得CAR的长度和柔性、(ii)其细胞表面密度、(iii)其通过振奋性信号转导自聚集并产生T细胞耗竭的趋势以及(iv)其与预期的靶抗原以外的分子的潜在结合来显著改变CAR功能。
[0006]因此，CAR特异性和功能可能受其结构(CAR长度和表位距离，间隔子，跨膜和胞内
结构域区域)及其灵敏性(抗体亲和力，抗原密度/亲和力，信号阈值)的影响。然而，存在旨在解决该问题的很少的有限研究和测定法，并且仍然没有证明最佳抗体或CAR构建体的选择，这通常导致对CAR功能的部分评估，而这些特性对于改善基于CAR的疗法是非常令人感兴趣的。
[0007]测试CAR识别靶细胞的能力和抗原特异性的方法是本领域已知的，例如通过测量细胞因子的释放(Clay等人,J.Immunol.,163:507
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513(1999))或通过测量细胞的细胞毒性(Zhao等人,J.Immunol.,174:4415
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4423(2005))。但是，这些方法可能很耗时且难以实施。因此，需要开发一种简单、快速且有效的方法来评估CAR表达细胞的功能性。

技术实现思路

[0008]为了克服这个问题，专利技术人开发了一种用于评估CAR表达细胞功能性的方法。该方法基于胞啃作用(trogocytosis)，其涉及抗原表达靶细胞和CAR表达细胞之间的膜转移。该测定允许以创新快速的方式评估CAR效应细胞活化，这取决于重组CAR结构的结构和灵敏性。
[0009]本专利技术涉及一种用于评估嵌合抗原受体(CAR)表达细胞的功能性的体外方法，其包括：
[0010]‑
用不同的标记物标记靶抗原表达细胞和CAR表达细胞，其中所述靶抗原表达细胞和所述CAR表达细胞是从同一细胞系制备的；
[0011]‑
共孵育标记的靶细胞和标记的CAR表达细胞，
[0012]‑
分析所述细胞以评估所述CAR表达细胞从所述靶抗原表达细胞的膜获取，所述膜获取指示所述CAR表达细胞对所述靶抗原的结合和/或活化能力，从而评估所述CAR表达细胞的功能性，
[0013]优选其中所述CAR表达细胞是免疫细胞。
[0014]优选地，共孵育进行至少1小时，优选1至5小时，甚至更优选1至3小时。特别地，以1:0.5至1:10的靶抗原表达细胞与CAR表达细胞的比例进行共孵育。
[0015]细胞分析通过细胞分选分析，优选流式细胞术分析进行。
[0016]优选地，用于评估嵌合抗原受体(CAR)表达细胞的功能性的体外方法还包括以下步骤：在共孵育标记的靶抗原细胞和标记的CAR表达细胞之前，将靶抗原表达细胞与识别与CAR衍生自的抗体相比相同或重叠的表位的抗体孵育。这样的抗体优选是单克隆抗体，优选包含CAR衍生自的单克隆抗体的CDR的单克隆抗体。
[0017]优选地，用于评估嵌合抗原受体(CAR)表达细胞的功能性的体外方法还包括测试不表达靶抗原的对照细胞。这样的方法可以进一步包括测试不识别靶抗原的对照CAR表达细胞。这样的方法还可以进一步包括功能性CAR表达细胞和/或CAR构建体的选择。
[0018]所述标记是膜标记物，优选亲脂性示踪剂或染料，甚至更优选选自MINI26、PKH26
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PCL、PKH67、MINI67、PKH67
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PCL、PKH26、PKH26
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PCL、Vybrant CM
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DiI、DiI和DiO。
[0019]优选地，细胞是免疫细胞，优选地选自T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、单核细胞和抗原呈递细胞。
[0020]本专利技术还涉及一种用于选择用于过继细胞疗法的功能性CAR表达细胞的体外方法，所述方法包括：
[0021](i)用编码CAR的核酸序列转导免疫细胞群，优选其中所述免疫细胞群已从来自待治疗的受试者的生物样品中分离，
[0022](ii)选择表达所述CAR的所述分离的细胞的亚群，和
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于评估嵌合抗原受体(CAR)表达细胞的功能性的体外方法，其包括：
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用不同的标记物标记靶抗原表达细胞和CAR表达细胞，其中所述靶抗原表达细胞和所述CAR表达细胞是从同一细胞系制备的；
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共孵育标记的靶细胞和标记的CAR表达细胞，
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分析所述细胞以评估所述CAR表达细胞从所述靶抗原表达细胞的膜获取，所述膜获取指示所述CAR表达细胞对所述靶抗原的结合和/或活化能力，从而评估所述CAR表达细胞的功能性；和其中所述细胞是免疫细胞。2.权利要求1所述的方法，其中所述共孵育进行至少1小时，优选1至5小时，甚至更优选1至3小时。3.权利要求1或2所述的方法，其中所述共孵育以1:0.5至1:10的靶抗原表达细胞与CAR表达细胞的比例进行。4.权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中细胞分析通过细胞分选分析，优选流式细胞术分析进行。5.权利要求1
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4中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：在共孵育标记的靶抗原细胞和标记的CAR表达细胞之前，将靶抗原表达细胞与识别与CAR衍生自的抗体相比相同或重叠的表位的抗体孵育。6.权利要求1
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5中任一项所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体，优选包含CAR衍生自的单克隆抗体的CDR的单克隆抗体。7.权利要求1
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6中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括测试不表达所述靶抗原的对照细胞。8.权利要求1
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7中任一项所述的方法，其中所述方法进一步...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：因维克蒂斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：