本发明专利技术涉及一种用于蛋白质和肽段分离的表面电荷改性的反相色谱分离材料的制备方法。该方法是以表面富含硅羟基的材料作为基质，首先进行单分子层的疏水基团修饰，之后在其表面基于五元氮杂环硅烷与硅羟基的反应进行表面电荷改性的可控修饰。本发明专利技术具有以下优点：(1)本发明专利技术的制备方法普适性好，表面富含硅羟基的硅胶颗粒、硅胶整体柱、有机-硅杂化整体柱均可采用这种方法进行制备；(2)本发明专利技术采用五元氮杂环硅烷与硅羟基反应，使材料表面具有仲胺基团，能有效屏蔽硅羟基的非特异性吸附，改善色谱峰型；(3)本方法可以通过控制反应溶剂以及反应时间控制表面电荷密度。反应时间控制表面电荷密度。反应时间控制表面电荷密度。
【技术实现步骤摘要】
一种表面电荷改性的反相色谱分离材料及制备和应用
[0001]本专利技术涉及反相色谱分离材料用于肽段和蛋白质的分离，具体地说是一种表面电荷改性的反相色谱分离材料的制备方法及其在肽段和蛋白质的高效分离。
技术介绍
[0002]蛋白质组学的分析策略分为自上而下的蛋白质组学和自下而上的蛋白质组学，分析对象分别是完整蛋白质和肽段。然而，由于生物样品中蛋白质及肽段的构成都非常复杂，因此在检测之前需要高分辨的分离手段。液相色谱由于其分辨率高、与质谱检测兼容等优点在蛋白质组学的研究中发挥着重要作用。在液相色谱中，分离材料是其核心，其中硅胶基质和有机-硅杂化基质由于其孔径可调性强、机械稳定性好等优势被广泛应用于色谱分离，但是存在严重的残留硅羟基非特异性吸附问题。在反相色谱模式中硅羟基的非特异性吸附会导致肽段、蛋白质在分离过程中产生严重的拖尾问题。本专利技术针对这个问题发展了一种表面电荷改性的反相色谱分离材料的制备方法，并用于蛋白质和肽段的分离。
技术实现思路
[0003]本专利技术的目的是提出一种表面电荷改性的反相色谱分离材料的制备方法，以解决目前传统硅胶基质以及有机-硅杂化基质分离材料对于样品非特异性吸附的问题，并将其用于蛋白质和肽段分离。
[0004]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0005]以表面富含硅羟基的材料作为基质，首先进行单分子层的疏水基团修饰；之后在其表面进行电荷修饰。具体步骤如下：
[0006](1)单分子层疏水基团修饰
[0007]首先配制反应溶液，反应溶液由硅烷化试剂和无水有机溶剂组成，反应溶液中硅烷化试剂的含量为5-60％。无水有机溶剂包括苯、甲苯、二氯甲烷、二甲亚砜、乙醚以及四氢呋喃中的一种或两种以上种；硅烷化试剂包括二甲基烷基氯硅烷类、二乙基烷基氯硅烷类、烷基二甲胺二甲基硅烷类中的一种或两种以上。
[0008]接着将表面富含有硅羟基的材料分散在反应溶液中进行反应或者将反应溶液通入整体柱基质中进行反应。反应温度为0-120℃，反应时间为1-24h。反应结束后使用配制反应溶液的无水有机溶剂进行洗涤。
[0009](2)表面电荷的修饰
[0010]首先配制反应溶液，反应溶液由五元氮杂环硅烷和无水有机溶剂组成，反应溶液中硅烷化试剂的含量为5-60％(v/v)。无水有机溶剂包括苯、甲苯、二氯甲烷、二甲亚砜、乙醚以及四氢呋喃中的一种或两种以上；五元氮杂环硅烷类包括N-(2-胺乙基)-2,2,4-三甲基-1-氮杂-2-硅杂环戊烷、N-甲基-氮杂-2,2,4-三甲基硅杂戊烷、N-正丁基-氮杂-2,2-二甲氧基硅杂戊烷、N-叔丁基-氮杂-2,2-二甲氧基硅杂戊烷、2,2-二甲氧基硅杂戊烷、2,2-二乙氧基硅杂戊烷、N-甲基-氮杂-2,2-二甲氧基硅杂戊烷中的一种或两种以上。接着将单分
子层疏水基团修饰的材料分散在反应溶液中进行反应或者将反应溶液通入整体柱基质中进行反应。反应温度为0-120℃，反应时间为1-24h。
[0011]反应结束后依次使用配制反应溶液的无水有机溶剂、乙腈进行洗涤。
[0012](3)将制备的毛细管柱作为分离柱，采用液相色谱系统，对蛋白质或者肽段样品进行分离。
[0013]本专利技术具有如下优点：
[0014](1)本专利技术的制备方法普适性好，表面富含硅羟基的硅胶颗粒、硅胶整体柱、有机-硅杂化整体柱均可采用这种方法进行制备；
[0015](2)本专利技术采用五元氮杂环硅烷与硅羟基反应，使材料表面具有仲胺基团，能有效屏蔽硅羟基的非特异性吸附，改善色谱峰型；
[0016](3)本方法可以通过控制反应溶剂以及反应时间控制表面电荷密度。
附图说明
[0017]图1表面电荷改性的C
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反相硅胶颗粒材料制备方法
[0018]图2表面电荷改性的C4反相有机-硅杂化柱的制备方法
[0019]图3表面电荷改性的C4反相有机-硅杂化柱的制备方法
[0020]图4采用制备的表面电荷改性的C
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反相有机-硅杂化柱分离BSA酶解肽段的色谱图
[0021]图5采用制备的表面电荷改性的C4反相有机-硅杂化柱分离五种标准蛋白质混合物的色谱图(五次平行分析)
具体实施方式
[0022]下面通过实施例对本专利技术提供的方法进行详述，但不以任何形式限制本专利技术。
[0023]实施例1
[0024]如图1所示，按照如下流程制备表面电荷改性的C
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反相硅胶颗粒材料
[0025](1)硅胶表面活化：将1g硅胶分散于30ml 6M盐酸中，搅拌下100℃回流3h。回流完成后，用砂芯漏斗进行抽滤，首先用蒸馏水洗至中性，然后用无水乙醇洗三次，最后在50℃下真空干燥。
[0026](2)C
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单分子层疏水基团的键合：将活化并干燥的硅胶颗粒分散在30ml20％二甲基十八烷基氯硅烷的甲苯溶液(v/v)中，120℃回流条件下搅拌反应24h。反应完成后，用砂芯漏斗进行抽滤，依次用无水甲苯，甲苯，丙酮和甲醇洗涤，然后在50℃真空干燥。
[0027](3)表面电荷的修饰：将修饰C
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基团硅胶颗粒分散于30ml 20％N-甲基-氮杂-2,2,4-三甲基硅杂戊烷的二氯甲烷溶液(v/v)，25℃搅拌24h。反应完成后，用砂芯漏斗进行抽滤，依次用无水二氯甲烷，二氯甲烷和甲醇洗涤，然后在50℃真空干燥，即得表面电荷改性的C
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反相色谱分离材料。
[0028]实施例2硅胶整体柱的表面改性
[0029]如图2所示，按照如下流程制备表面电荷改性的C
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/C4反相硅胶整体柱：
[0030](1)硅胶整体柱基质的制备：
[0031]称取0.2400g的PEG和0.1800g尿素溶于2ml 0.01M HAc，向其中缓慢滴加1.12ml TMOS。在冰水浴条件下，剧烈搅拌40分钟形成澄清透明溶胶。将溶胶液缓慢引入经预处理的
75μm毛细管，然后用硅橡胶封住毛细管的两端，将其置于水浴锅中，40℃反应24h。然后将毛细管柱转移至盛有去离子水的反应釜中，将反应釜放置在烘箱中，直接升温到120℃，反应3h。采用高效液相色谱泵依次向所得的毛细管整体柱中通入大量去离子水和甲醇，以除去材料中的模板剂和未反应完全的试剂。接着将毛细管整体柱置于50℃烘箱中，缓慢放干。最后将整体柱置于马弗炉中，以1℃/min的速率从室温程序升温到200℃，在此温度下下煅烧25h后，冷却至室温，待用。
[0032](2)C
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/C4单分子层疏水基团的键合：向硅胶整体柱中通入20％二甲基十八烷基氯硅烷(或者二甲基丁基氯硅烷)的甲苯溶液(v/v)中，60℃条件下反应24h。反应完成后，用甲苯冲洗。
[0033](3)表面电荷的修饰：向修饰C
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/C4基团的硅胶整体柱中通入20％N-甲基-氮杂-2,2,4-三甲基硅杂戊烷本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种表面电荷改性的反相色谱分离材料的制备方法，其特征在于：以表面富含硅羟基的材料作为基质，首先进行单分子层的疏水基团修饰；之后基于五元氮杂环硅烷与硅羟基的反应进行表面电荷改性修饰；得到反相色谱分离材料。2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：表面富含有硅羟基的材料包括硅胶颗粒、硅胶整体柱、有机-硅杂化整体柱中的一种或两种以上。3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的硅胶颗粒的粒径范围是100nm-10μm；所述的硅胶整体柱和有机-硅杂化整体柱是在内径为5-500μm的毛细管中聚合而成的。4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：单分子层的疏水基团修饰，修饰基团包括丁基、辛基、苯基、十二烷基、十八烷基的一种或两种以上。5.按照权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征在于：单分子层疏水基团修饰是将表面富含有硅羟基的材料分散在反应溶液中进行反应或者将反应溶液通入整体柱基质中进行反应；反应溶液由硅烷化试剂和有机溶剂组成：溶剂包括苯、甲苯、二氯甲烷、二甲亚砜、乙醚以及四氢呋喃中的一种或两种以上；硅烷化试剂包括二甲基烷基氯硅烷类、二乙基烷基氯硅烷类、烷基二甲胺二甲基硅烷类中的一种或两种以上；反应溶液中硅烷化...
【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，王超，梁玉，杨开广，梁振，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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