一种防污染耗材以及应用该防污染耗材进行CRISPR分子诊断的方法技术

本发明专利技术提供了一种防污染耗材以及应用该防污染耗材进行CRISPR分子诊断核酸检测的方法，属于核酸检测分子诊断技术领域，本发明专利技术提供的防污染耗材包括反应外管、套管和反应内管，反应内管自上而下依次包括第二空心圆柱上体、第二类锥形下体；所述第二空心圆柱上体顶端外延连接有垂直于所述第二空心圆柱上体的固定圆环；所述第二类锥形下体底部设置若干排液孔；排液孔的直径为0.01～0.8mm；所述排液孔进行疏水处理；所述反应内管通过套管固定于所述反应外管内部。本发明专利技术提供的防污染耗材能够保证以CRISPR技术为基础的核酸检测在不降低灵敏度，不导致较高假阳性的前提下，减少实验操作，防止污染，提高核酸检测的效率和准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种防污染耗材以及应用该防污染耗材进行CRISPR分子诊断的方法
本专利技术属于核酸分子诊断
，尤其涉及一种防污染耗材以及应用该防污染耗材进行CRISPR分子诊断的方法。
技术介绍
快速、准确、灵敏、定量检测特定核酸序列在人类传染病的诊断、粮食安全、病原体的测定、全球生物安全以及在环境分析中跟踪生物污染以及环境质量监测等领域发挥着越来越重要的作用。新型冠状病毒的流行更是给人们的生命安全带来了巨大的威胁。新型冠状病毒迅速爆发的原因缺少有效的检测手段；目前世界统一认准的标准检测方法是PCR检测，但是这种方法存在一定的缺陷，检测周期长，完成一次核酸检测大约需要两到三个小时；另外，PCR检测还需要专门的技术人员，大型的仪器设备，这些条件都限制了该方法的应用。除了传统标准PCR检测之外，还有RPA(重组酶聚合酶扩增)技术，LAMP(环介导的等温扩增)技术，RCA(滚环扩增)技术，CPA(交叉引物扩增)技术以及PSR(聚合酶螺旋反应)技术等主流的核酸扩增检测技术，但是这些方法也都存在一定的优势和缺陷，比如RPA(重组酶聚合酶扩增)技术，其响应速度快，指数级放大但是RPA灵敏度较低，不能够满足临床检测要求；再比如LAMP(环介导的等温扩增)技术，具有较高的灵敏度以及特异性，但是其引物设计复杂。因此，缺乏一种简单且有效的核酸检测方法，缩短检测时间，提高检测灵敏度，抑制病毒的传播速度。CRISPR全称为“规律成簇的间隔短回文重复序列”(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)是一种广泛存在于古细菌和细菌的适应性免疫系统。CRISPR系统最早是在20世纪90年代初在大肠杆菌的基因组中发现。2013年，基因定点编辑技术CRISPR/Cas9被研究人员发现，并将其成功应用，自此CRISPR技术开始成为最受欢迎的基因编辑工具。2017年，基因编辑领域国际顶尖学者哈佛大学博德研究所张锋教授团队将CRISPR技术应用到核酸检测领域，在其和加州大学伯克利分校的JenniferDoudna团队共同努力下，该技术已被用于检测多种病原生物的核酸分子(如寨卡病毒、登革热病毒、结核分枝杆菌等)，两个团队2017年至今基于CRISPR核酸检测技术已经在《Science》、《Nature》及其子刊发表多篇高水平文章，2018年在由中国科学院和中国工程院组织的两院院士投票中基于CRISPR开发的病原体或肿瘤体外诊断技术入选2018年世界十大科技进展。此后，以Cas12、Cas13、Cas14等CRISPR酶为基础的各种核酸检测平台也应运而生。CRISPR技术相比较传统的核酸检测方法不仅在检测的成本、效率、便携性、特异性、简便性等方面都显示出了巨大的优势，同时该项技术还具有较好的生物相容性，能够跟其他技术结合，从而更加简便高灵敏的进行核酸检测，该项技术也被誉为下一代的新型核酸检测技术。但是CRISPR技术还存在一些问题，为了提高检测灵敏度，在进行CRISPR核酸检测反应前通常需要先对核酸扩增，扩增后再加入CRISPR反应体系实现靶标核酸的检测。即需要进行扩增后开盖、试剂的转移、闭盖等操作，极易造成实验室气溶胶污染，这样不仅导致后续结果出现较高的假阳性问题而且也极易造成实验室以及相关器材的交叉污染，同时还需要花费大量的时间去完成一系列操作，造成人力物力的浪费。因此急需寻找到一种方便可行的装置或者方法去解决CRISPR技术所面临的核酸扩增到核酸检测这一步过程中开盖、样本核酸的转移和闭盖等引起的实验室气溶胶污染等问题。2017年基因编辑领域国际顶尖学者哈佛大学博德研究所张锋教授团队[Gootenberg,J.S.etal.NucleicaciddetectionwithCRISPR-Cas13a/C2c2[J].Science356,438-442(2017)]将用于核酸扩增的RPA试剂以及核酸检测的CRISPR试剂相混合，使两个反应在同一个试管中同时进行，实现一边扩增一边检测。这样就将核酸扩增以及核酸检测合成为一步，避免了因开盖、样本核酸的转移等操作，而造成的气溶胶污染，提高了核酸检测的效率，但这种边扩增边检测的方法降低了检测灵敏度。2019年HuihuiLiu、YongmingWang[HuihuiLiu,YongmingWang.etal.Cas12aVDet:ACRISPR/Cas12a-BasedPlatformforRapidandVisualNucleicAcidDetection[J].AmericanChemicalSociety91,12156–12161(2019).]等人提出了一种基于CRISPR/Cas12a的方法，称为“Cas12aVDet”，用于快速核酸检测，避免因开盖操作所造成的气溶胶污染，减少实验操作，提高检测效率。该方法是通过在单个反应系统中将重组酶聚合酶扩增(RPA)与CRISPR试剂整合在一个试管中，但是将CRISPR试剂添加到经过独特设计的管内壁上，在RPA反应完成后，经离心将CRISPR试剂添加到RPA反应溶液中，实现核酸检测。这样可以在30min内完成检测，同时避免因开盖、样本核酸的转移等操作造成的气溶胶污染等问题，但这种方法在实际使用过程中难以操作，存在CRISPR试剂和RPA溶液提前混合的可能，降低灵敏度。MengyaoZhang、ChengzhiLiu等人[MengyaoZhang,ChengzhiLiu.etal.SelectiveendpointvisualizeddetectionofVibrioparahaemolyticuswithCRISPR/Cas12aassistedPCRusingthermalcyclerforon-siteapplication[J].ScienceDirect214,1873-3573(2020).]借助于CRISPR和PCR技术开发了一个检测副溶血弧菌的检测平台。该方法将CRISPR试剂预先添加到试管盖内，然后在微型热循环仪上将PCR试剂盖关闭，进行PCR反应,通过液滴间的吸附力，CRISPR试剂将会吸附在试管盖上，进而将两种试剂分开。在这个过程中，为避免酶的失活，热循环仪的上盖将会打开，使整个反应一部分在热循环仪上，一部分暴露在空气中。在扩增完成后，在通过离心将吸附在试管盖上的CRISPR试剂甩到试管底部，与PCR试剂相混合，并用dUTP代替PCR系统中的dTTP进行核酸检测，这样就避免了开盖、样本核酸的转移等操作，这种方法和将CRISPR试剂添加在试管壁类似，也可能导致CRISPR试剂和RPA溶液提前混合和误操作，降低灵敏度。现有的技术仍然无法在不导致假阳性、不降低灵敏度的情况下，实现无污染操作。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于解决以CRISPR技术为基础的核酸检测过程中因为开盖、样本核酸的转移、闭盖等操作，引起的实验室气溶胶污染的问题；本专利技术提供的防污染耗材能够保证以CRISPR技术为基础的核酸检测在不降低灵敏度，不导致较高假阳性的前提下，使检测系统具有较高的鲁棒性，减本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种防污染耗材，其特征在于，包括反应外管、套管和反应内管，/n所述反应外管自上而下依次包括管盖、第一空心圆柱上体、底部封闭的第一类锥形下体；/n所述第一类锥形下体的最大内径小于第一空心圆柱上体的内径；/n所述套管的外径与所述反应外管第一空心圆柱上体的内径相同；/n所述套管的高度小于所述第一空心圆柱上体的高度；/n所述反应内管自上而下依次包括第二空心圆柱上体和第二类锥形下体；所述第二空心圆柱上体顶端外延连接有垂直于所述第二空心圆柱上体的固定圆环；所述第二类锥形下体底部设置若干排液孔；所述排液孔的直径为0.01～0.8mm；所述排液孔进行疏水处理；/n所述第二空心圆柱上体的外径小于等于所述套管的内径；所述固定圆环的外径大于所述套管的内径并且小于等于所述第一空心圆柱上体的内径；/n所述反应内管通过套管固定于所述反应外管内部。/n

【技术特征摘要】
1.一种防污染耗材，其特征在于，包括反应外管、套管和反应内管，
所述反应外管自上而下依次包括管盖、第一空心圆柱上体、底部封闭的第一类锥形下体；
所述第一类锥形下体的最大内径小于第一空心圆柱上体的内径；
所述套管的外径与所述反应外管第一空心圆柱上体的内径相同；
所述套管的高度小于所述第一空心圆柱上体的高度；
所述反应内管自上而下依次包括第二空心圆柱上体和第二类锥形下体；所述第二空心圆柱上体顶端外延连接有垂直于所述第二空心圆柱上体的固定圆环；所述第二类锥形下体底部设置若干排液孔；所述排液孔的直径为0.01～0.8mm；所述排液孔进行疏水处理；
所述第二空心圆柱上体的外径小于等于所述套管的内径；所述固定圆环的外径大于所述套管的内径并且小于等于所述第一空心圆柱上体的内径；
所述反应内管通过套管固定于所述反应外管内部。


2.根据权利要求1所述的防污染耗材，其特征在于，所述疏水处理包括以下步骤：1)向所述反应内管中加入异丙醇、离心；再加入去离子水、离心；2)重复步骤1)中的操作2～3次后，烘干所述反应内管；3)向烘干后的反应内管中加入质量百分含量为0.5％的FC-77氟化油的TeflonAF溶液浸泡。


3.根据权利要求1或2所述的防污染耗材，其特征在于，所述排液孔的数量为1...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡飞，刘艳飞，彭年才，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61