一种条件性细胞死亡动物模型的构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种条件性细胞死亡动物模型的构建方法及应用，属于医药技术领域。该方法通过设计并构建携带条件性细胞死亡序列的打靶载体，并利用该打靶载体得到了条件性细胞死亡动物模型。通过本发明专利技术构建的条件性细胞死亡小鼠模型，可以建立各种损伤模型，如肝损伤模型、胰岛损伤模型、心脏损伤模型、脑损伤模型等，为细胞及组织的再生研究提供更可靠的模型工具。还可以用来制备各种疾病模型，如神经退行性疾病模型、肝炎模型、I型糖尿病模型等，为研究这些疾病的发病机制及治疗方法提供更直接、疗效更明确的工具。

【技术实现步骤摘要】
一种条件性细胞死亡动物模型的构建方法及应用
本专利技术属于医药
，具体涉及一种条件性细胞死亡动物模型的构建方法及应用。
技术介绍
细胞焦亡(Pyroptosis)又称细胞炎性坏死，是一种程序性细胞死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。细胞焦亡是机体一种重要的天然免疫反应，在抗击感染中发挥重要作用。细胞焦亡是近年来发现并证实的一种新的程序性细胞死亡方式，其特征为依赖于半胱天冬酶(Caspase)，并伴有大量促炎症因子的释放。Caspase家族包括十多个成员，其中绝大部分都在细胞凋亡中发挥功能。细胞焦亡的形态学特征、发生及调控机制等均不同于凋亡等其他程序性死亡方式。研究表明，细胞焦亡广泛参与感染性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病等的发生发展，而Gasdermin蛋白家族在细胞焦亡过程中发挥了关键作用。细胞焦亡是由Gasdermin蛋白介导的细胞程序性坏死。Gasdermin是一个能导致细胞焦亡的蛋白家族，包括A、B、C、D、E等多种亚型，存在于多种生物体内。该家族蛋白包含了N端结构域和C端结构域两部分，这些Gasdermin蛋白的N端结构域大都可以引发细胞焦亡。实验证明，半胱天冬酶(Caspase)能够特异性地对Gasdermin蛋白进行切割，从而将Gasdermin蛋白切割成两部分。其中N端结构域是引发细胞焦亡的活性元件。进一步研究发现，Gasdermin蛋白N端结构域能高效特异地破坏含有磷酸化磷脂酰肌醇或心磷脂的脂质体，能在特异磷脂或天然磷脂组成的膜形成很多蜂窝状的孔道，细胞随后出现体积膨胀和细胞膜向胞外吐泡的现象，最终导致细胞焦亡。条件性细胞死亡实验动物模型是以染色体位点特异性重组酶系统为基础构建的，目前常用的位点特异性重组酶系统为Cre-LoxP和Dre-rox系统。通过在载体上游放置一对LoxP-Stop-LoxP或者rox-stop-rox序列，可以得到条件性细胞死亡模型动物，再将条件性细胞死亡模型动物与带有细胞特异性表达的Cre动物或者Dre动物交配繁殖，即可获得在特定的细胞死亡动物，即获得条件性细胞死亡动物模型。目前细胞死亡模型动物大多是使用白喉毒素介导的细胞凋亡模型。白喉毒素是白喉棒状杆菌产生的细菌外毒素，它具有抑制蛋白质合成的作用，与细胞表面的白喉毒素受体结合可以使机体产生严重的中毒反应。白喉毒素的这一特点被用来构建敏感有效的细胞死亡系统。然而白喉毒素并不存在于小鼠等实验动物体内，因此在构建动物模型时，需要先使实验动物表达出白喉毒素受体，再注射白喉毒素达到细胞死亡效果。由于使用白喉毒素的细胞死亡模型动物存在的上述缺陷，因此有必要开发一种全新的条件性细胞死亡的动物模型。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种条件性细胞死亡动物模型的构建方法及应用，通过该方法构建的条件性细胞死亡小鼠模型，可以建立各种损伤模型，如肝损伤模型、胰岛损伤模型、心脏损伤模型、脑损伤模型等，为细胞及组织的再生研究提供更可靠的模型工具。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种条件性细胞死亡动物模型的构建方法，包括以下步骤：步骤1，确定条件性细胞死亡序列在模型动物基因序列中的插入位点，设计sgRNA；步骤2，根据得到的sgRNA，设计并构建携带条件性细胞死亡序列的打靶载体；步骤3，将打靶载体、Cas9和sgRNA注射至模型动物的受精卵中，再将受精卵转移至假孕雌性模型动物体内，后代出生后，经PCR鉴定筛选出中靶动物模型F0，将F0与野生型模型动物配繁获得F1，F1互配后，即可获得所述条件性细胞死亡动物模型。进一步地，所述条件性细胞死亡动物模型采用的模型动物为小鼠。进一步地，所述模型动物为C57BL/6J小鼠。进一步地，步骤1中所述插入位点为小鼠H11位点，所述sgRNA序列如SEQIDNo.1所示。进一步地，所述打靶载体的序列为pTRE(3G)-Gsdmd-NT-CAG-LSL-rTTA(3G)-IRES-ZsGreen，其中：pTRE(3G)为四环素诱导型启动子Gsdmd-NT为Gasdermin蛋白被半胱天冬酶切割后的N结构域的编码基因CAG为启动子LSL为loxp-stop-loxp序列rTTA(3G)为四环素转录激活调控因子IRES为内在核糖体进入位点ZsGreen为荧光蛋白基因。采用上述构建方法得到的条件性细胞死亡动物模型。条件性细胞死亡动物模型在制备动物损伤模型中的应用。所述损伤模型可以为肝损伤模型、胰岛损伤模型、心脏损伤模型、脑损伤模型等；所述疾病模型可以为神经退行性疾病模型、肝炎模型、I型糖尿病模型等。条件性细胞死亡动物体内可以产生特定细胞死亡效果，通过本专利技术构建的条件性细胞死亡小鼠模型，可以建立各种损伤模型，如肝损伤模型、胰岛损伤模型、心脏损伤模型、脑损伤模型等，为细胞及组织的再生研究提供更可靠的模型工具。还可以用来制备各种疾病模型，如神经退行性疾病模型、肝炎模型、I型糖尿病模型等，为研究这些疾病的发病机制及治疗方法提供更直接、疗效更明确的工具。附图说明图1为本专利技术的打靶载体的结构示意图。图2为实施例1中F0代小鼠PCR鉴定结果。其中：数字为鼠尾号，WT为C57BL/6J野生型，P为阳性对照，M为DNAMarker，N为空白对照。图3为实施例1中F1代小鼠PCR鉴定结果。其中：数字为鼠尾号，WT为C57BL/6J野生型，N为空白对照，M为DNAMarker。图4为GSDMD+/-小鼠Dox饮水诱导后肝脏病理切片和荧光观察结果。具体实施方式目前细胞死亡模型动物大多是使用白喉毒素介导的细胞凋亡模型。白喉毒素是白喉棒状杆菌产生的细菌外毒素，它具有抑制蛋白质合成的作用，与细胞表面的白喉毒素受体结合可以使机体产生严重的中毒反应。白喉毒素的这一特点常被用来构建敏感有效的细胞死亡系统。然而白喉毒素并不存在于小鼠等实验动物体内，因此在构建动物模型时，需要先使实验动物表达出白喉毒素受体，再注射白喉毒素达到细胞死亡效果。由于使用白喉毒素的细胞死亡模型动物存在的上述缺陷，因此有必要开发一种全新的条件性细胞死亡的动物模型，利用该模型小鼠与Cre小鼠交配所产生的后代能够具备以下优点：(1)能控制基因表达，达到条件性细胞死亡的效果；(2)可直接在实验动物细胞上产生细胞死亡效果，操作方便，用时短。本专利技术提供了一种用于条件性细胞死亡的重组载体及其制备方法、条件性细胞死亡模型动物的制备方法及其用途。条件性细胞死亡动物体内可以产生特定细胞死亡效果，建立各种损伤模型，如肝损伤模型、胰岛损伤模型、心脏损伤模型、脑损伤模型等，为细胞及组织的再生研究提供更可靠的模型工具；还可以用来制备各种疾病模型，如神经退行性疾病模型、肝炎模型、I型糖尿病模型等，为研究这些疾病的发病机制及治疗方法提供更直接、疗效更明确的工具。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种条件性细胞死亡动物模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：/n步骤1，确定条件性细胞死亡序列在模型动物基因序列中的插入位点，设计sgRNA；/n步骤2，根据得到的sgRNA，设计并构建携带条件性细胞死亡序列的打靶载体；/n步骤3，将打靶载体、Cas9和sgRNA注射至模型动物的受精卵中，再将受精卵转移至假孕雌性模型动物体内，后代出生后，经PCR鉴定筛选出中靶动物模型F0，将F0与野生型模型动物配繁获得F1，F1互配后，即可获得所述条件性细胞死亡动物模型。/n

【技术特征摘要】
1.一种条件性细胞死亡动物模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，确定条件性细胞死亡序列在模型动物基因序列中的插入位点，设计sgRNA；
步骤2，根据得到的sgRNA，设计并构建携带条件性细胞死亡序列的打靶载体；
步骤3，将打靶载体、Cas9和sgRNA注射至模型动物的受精卵中，再将受精卵转移至假孕雌性模型动物体内，后代出生后，经PCR鉴定筛选出中靶动物模型F0，将F0与野生型模型动物配繁获得F1，F1互配后，即可获得所述条件性细胞死亡动物模型。


2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述条件性细胞死亡动物模型采用的模型动物为小鼠。


3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述模型动物为C57BL/6J小鼠。


4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤1中所述插入位点为小鼠H11位点，所述sgRNA序列如SEQIDNo.1所示。


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【专利技术属性】
技术研发人员：史培良，
申请(专利权)人：成都药康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51