用于确定光学介质的折射率的方法和显微镜技术

介绍一种用于确定显微镜(10、78)中的光学介质的折射率的方法，该显微镜具有面向样本空间(14)的物镜(12)，其中，具有待确定的折射率的所述光学介质是两种光学介质(26、28)之一，这些光学介质在所述样本空间(14)中与盖玻片或载玻片(16)的两个相反的表面(64、68)邻接，由此形成两个部分反射的界面，这些界面相距所述物镜(12)以不同的间距布置。在该方法中，使得测量光束(34)透过所述物镜(12)在倾斜地入射情况下转向至所述盖玻片或载玻片(16)，产生两个在空间上彼此分开的反射光束(54a、54b)，其方式为，使得所述测量光束(34)分别部分地在两个所述界面上反射，使得两个所述反射光束(54a、54b)被所述物镜(12)接收，并且转向至对位置灵敏的探测器(60)，借助所述对位置灵敏的探测器(36)来检测两个所述反射光束(54a、54b)的强度，基于两个所述反射光束(54a、54b)的所检测的强度来计算所述光学介质的折射率。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于确定光学介质的折射率的方法和显微镜
本专利技术涉及一种用于确定显微镜中的光学介质的折射率的方法，该显微镜具有面向样本空间的物镜，其中，具有待确定的折射率的光学介质是两种光学介质之一，这些光学介质在样本空间中与盖玻片或载玻片的两个相反的表面邻接，由此形成两个部分反射的界面，这些界面相距物镜以不同的间距布置。本专利技术还涉及一种显微镜，其带有用于确定光学介质的折射率的机构。
技术介绍
样本的光纤维成像受不同的光学介质影响，这些介质在显微镜的样本空间中彼此邻接。这些光学介质由于它们的折射率不同而形成了界面，在这些界面处折射率跳跃式地变化。这些界面中的每一个都根据那里的折射率突变有多大而不同地影响到光学成像。尤其是球面像差受折射率的跳跃式变化的显著影响。参与成像的光学介质通常包括盖玻片或载玻片以及从相反侧与盖玻片或载玻片邻接的两种介质。后者例如由位于盖玻片或载玻片与物镜之间的浸没介质和在样本周围的包埋介质构成。为了能够实现有效地矫正受折射率的跳跃式变化影响的成像误差，重要的是，知道所用光学介质的折射率。在此，往往事先以较高的精度知道盖玻片或载玻片的和浸没介质的折射率。但这并不适用于在样本周围的包埋介质的折射率。该折射率因此要在专门为此规定的测量中在显微镜之外或之内求取。在显微镜之外测量折射率牵涉到在测量之后进行的样本制备的不可衡量性。在显微镜之外得到的测量值与在光显微成像中实际上起作用的折射率的关系无法得到保证。因而在有些情况下，例如在活细胞显微术中，包埋介质的折射率显著地受样本影响，因而在显微制备之外根本就无法以足够的精度测量。DE102006021996A1公开了一种用于内部全反射显微术(简写为TIRF)的显微镜，其能实现确定显微镜内部的折射率。该TIRF显微镜包括物镜，利用该物镜对样本施加以瞬逝的照明。在样本上全反射的照明光借助探测器予以检测。在样本上反射的照明光的强度在跃迁处从最大值下降到零，借助该跃迁来确定全反射的入射角。然后基于入射角来求取折射率。但对折射率的这种确定需要具有高数值孔径的浸没物镜，以便能够在全反射情况下照明样本。这种物镜制造繁琐，因而昂贵。关于现有技术，还参见DE102010030430A1，其中公开了一种用于显微镜的三角自动聚焦机构。该自动聚焦机构在样本上产生狭缝图像，该狭缝图像成像到对位置灵敏的探测器上。通过由探测器检测到的入射位置来控制自动聚焦。
技术实现思路
本专利技术的目的是，提出能实现简单地且精确地确定光学介质的折射率的方法和显微镜。该目的通过根据权利要求1的方法和根据权利要求9的显微镜得以实现。有利的改进分别在从属权利要求中给出。根据本专利技术的方法用于确定在显微镜中的光学介质的折射率，该显微镜具有面向样本空间的物镜，其中，带有待确定的折射率的光学介质是两种光学介质之一，这些光学介质在样本空间中与盖玻片或载玻片的两个相反的表面邻接，并且由此形成两个部分反射的界面，这些界面相距物镜以不同的间距布置。在该方法中，使得测量光束透过物镜在倾斜地入射情况下转向至盖玻片或载玻片。产生两个在空间上彼此分开的反射光束，其方式为，使得测量光束分别部分地在两个界面上反射。使得两个反射光束被物镜接收，并且转向至对位置灵敏的探测器。借助对位置灵敏的探测器来检测两个反射光束的强度。基于两个反射光束的所检测的强度来求取光学介质的折射率。在本申请中，盖玻片或载玻片尤其是指遮盖样本的盖玻片、载物片、皮氏培养皿的底部或者微量滴定板的阱底部。两个反射光束的强度与测量光束在两个界面上的反射和透射有关，这些界面通过盖玻片或载玻片和从相反侧与盖玻片或载玻片邻接的两种光学介质来规定。两个在空间上彼此分开的反射光束的强度最终基于反射和透射过程，这些过程因而主要由盖玻片或载玻片的以及与盖玻片或载玻片邻接的光学介质的折射率决定。如果盖玻片或载玻片的折射率以及与其邻接的两种光学介质之一的折射率是已知的，则可以由通过对位置灵敏的探测器检测到的强度和对测量光束在样本空间中的入射角度的了解，可靠地确定另一种介质的折射率。使得测量光束倾斜地转向至盖玻片或载玻片，由此实现两个反射光束的在空间上的分开。由于两个部分反射的界面在轴向上相互错开，也就是说，沿着物镜的光学轴线彼此间隔开，所以，测量光束倾斜地入射到两个界面上负责使得两个反射光束在不同的光路上反射回到物镜中。结果，于是可以在对位置灵敏的探测器上在不同的入射地点彼此分开地检测两个反射光束。本专利技术能实现简单且精确地确定显微镜内部的光学介质的折射率。这可以有益地用于调节其它的显微镜参数。特别地，本专利技术能实现针对不同的包埋介质在显微镜物镜上规定的矫正调节的自动化，其方式例如为，根据所求取的折射率自动地控制在显微镜物镜中含有的矫正透镜。也可行的是，根据所求取的折射率，在反卷积的过程中对点扩展函数进行建模。在一种有利的改进中，一种光学介质的折射率与另一种光学介质的折射率、盖玻片或载玻片的折射率和测量光束的数值孔径相关地求取。在此，测量光束的数值孔径可以通过物镜的焦距和测量光束在物镜光瞳中的位置来确定。两个界面的反射率和透射率、盖玻片或载玻片的折射率和规定了相应的界面的光学介质的折射率及测量光束的数值孔径通过所谓的菲涅耳公式相互关联。反射率和透射率可以基于两个反射光束的强度来确定。此外如果盖玻片或载玻片的折射率、测量光束的数值孔径以及两种光学介质之一的折射率是已知的，则可以简单地计算出另一种介质的折射率。在一种优选的实施方式中，一种光学介质的折射率基于两个反射光束的强度比例来求取。由此，根据本专利技术对折射率的测量仿佛是自我参照的。这意味着，折射率可以无关于测量光束的强度来确定，也就是说，无需知道该强度。优选地，把测量光束引入物镜的入射光瞳的部分区域中，该部分区域相对于入射光瞳的中心错开。通过这种方式，物镜的入射光瞳被测量光束偏心地照明，由此使得测量光束在从物镜出来时相对于物镜的光学轴线倾斜。对入射光瞳的这种偏心的照明于是能实现以特别简单的方式使得在两个界面上产生的反射光束按所希望地在空间上分开。这些反射光束于是优选被引回到物镜中，从而它们在与测量光束的传播方向相反的方向上经过入射光瞳的相对于入射光瞳的前述部分区域错开的另一部分区域。在一种有利的设计中规定，通过测量光束在两个界面上分别产生测量图样，两个测量图样被两个反射光束成像到对位置灵敏的探测器上。于是例如可行的是，相应的测量图样以狭缝光阑图像的形式产生，该狭缝光阑是发出测量光束的光源的一部分或者置于该光源之前。优选地，以在空间上的强度分布的形式来检测成像到对位置灵敏的探测器上的两个测量图样，由该强度分布来确定两个反射光束的强度。如果成像到对位置灵敏的探测器上的测量图样例如由狭缝光阑的图像产生，则得到前述的强度分布，其方式为，沿着与狭缝光阑的纵向方向平行的方向，对探测器上的相应的光圈图像予以积分。相应的光圈图像的在探测器上检测到的位置，在这种情况下通过在强度分布中出现的峰值得到体现，该位置与在相关的部分反射的界面与物镜之间的间距有关。优选地，根本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于确定显微镜(10、78)中的光学介质的折射率的方法，该显微镜具有面向样本空间(14)的物镜(12)，/n其中，具有待确定的折射率的所述光学介质是两种光学介质(26、28)之一，这些光学介质在所述样本空间(14)中与盖玻片或载玻片(24)的两个相反的表面(64、68)邻接，由此形成两个部分反射的界面，这些界面相距所述物镜(12)以不同的间距布置，/n其特征在于，/n使得测量光束(34)透过所述物镜(12)在倾斜地入射情况下转向至所述盖玻片或载玻片(24)，/n产生两个在空间上彼此分开的反射光束(54a、54b)，其方式为，使得所述测量光束(34)分别部分地在两个所述界面上反射，/n使得两个所述反射光束(54a、54b)被所述物镜(12)接收，并且转向至对位置灵敏的探测器(60)，/n借助所述对位置灵敏的探测器(60)来检测两个所述反射光束(54a、54b)的强度，和/n基于两个所述反射光束(54a、54b)的所检测的强度来求取所述光学介质的折射率。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181019 DE 102018126002.41.一种用于确定显微镜(10、78)中的光学介质的折射率的方法，该显微镜具有面向样本空间(14)的物镜(12)，
其中，具有待确定的折射率的所述光学介质是两种光学介质(26、28)之一，这些光学介质在所述样本空间(14)中与盖玻片或载玻片(24)的两个相反的表面(64、68)邻接，由此形成两个部分反射的界面，这些界面相距所述物镜(12)以不同的间距布置，
其特征在于，
使得测量光束(34)透过所述物镜(12)在倾斜地入射情况下转向至所述盖玻片或载玻片(24)，
产生两个在空间上彼此分开的反射光束(54a、54b)，其方式为，使得所述测量光束(34)分别部分地在两个所述界面上反射，
使得两个所述反射光束(54a、54b)被所述物镜(12)接收，并且转向至对位置灵敏的探测器(60)，
借助所述对位置灵敏的探测器(60)来检测两个所述反射光束(54a、54b)的强度，和
基于两个所述反射光束(54a、54b)的所检测的强度来求取所述光学介质的折射率。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，一种光学介质的折射率与另一种光学介质的折射率、所述盖玻片或载玻片(24)的折射率和所述测量光束(34)的数值孔径相关地求取。


3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，一种光学介质的折射率基于两个所述反射光束(54a、54b)的强度比例来求取。


4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，把所述测量光束(34)引入所述物镜(12)的入射光瞳(52)的部分区域中，该部分区域相对于所述入射光瞳(52)的中心错开。


5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，通过所述测量光束(34)在两个界面上分别产生测量图样，两个测量图样被两个所述反射光束(54a、54b)成像到所述对位置灵敏的探测器(60)上。


6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，以在空间上的强度分布(V)的形式来检测成像到所述对位置灵敏的探测器(60)上的两个测量图样，由该强度分布来确定两个所述反射光束(54a、54b)的强度。


7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，所述一种光学介质是用于样本的包埋介质，该包埋介质与所述盖玻片或载玻片(24)的两个面(64、68)之一邻接。


8.如权利要求1～7中任一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：亚历山大·韦斯，克里斯蒂安·舒曼，罗尼亚·卡佩尔曼，
申请(专利权)人：莱卡微系统CMS有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE