一种基于MeRIP-Seq技术挖掘藏绵羊高原低氧适应性相关基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于MeRIP‑Seq技术挖掘藏绵羊高原低氧适应性相关基因的方法，包括：对所提取的绵羊肺脏组织RNA依次进行RNA免疫沉淀、文库构建和测序；对测序得到的原始数据进行质控过滤得到高质量数据，将该高质量数据与绵羊参考基因组比对得到具有唯一比对位置的数据，将该唯一比对位置的数据进行可视化分析；根据上述唯一位置的数据进行m

【技术实现步骤摘要】
一种基于MeRIP-Seq技术挖掘藏绵羊高原低氧适应性相关基因的方法
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种基于MeRIP-Seq技术挖掘藏绵羊高原低氧适应性相关基因的方法。
技术介绍
高原环境是动物生产最具有挑战的不利条件之一，而高原低氧又是诸多环境因子中最关键的因子之一。高原低氧环境会直接或间接影响动物生理、生产和健康等。在生理上表现为喘息、血管扩张快和血液指标变化等；在生产上表现为繁殖力低和体重增长慢等；在健康上表现为免疫力和抗病力下降等。怕高寒和惧低氧是绵羊重要的生物学特性。青藏高原作为藏绵羊的中心产区，扎什加羊产区位于青海省玉树州曲麻莱县麻多乡扎什加村和巴颜村，平均海拔在4500m以上，在高原低氧状态下，藏绵羊的机体内哪个或哪些基因和代谢通路是如何发挥调控作用以进行调节和适应是非常值得深入去研究的。现有多项研究中，通过将缺氧与mRNA中m6A(N6-methyladenosine，N6-甲基腺苷)甲基化修饰联系起来，m6A脱甲基化酶ALKBH5(AlkBhomologue5，AlkB同源物5)是缺氧诱导因子1α(hypoxia-induciblefactor-1α，HIF-1α)的直接靶点，缺氧环境使ALKBH5表达增加而促进m6A脱甲基化，同时增强了一些多能性因子(如NANOG)的稳定性，这是肿瘤形成和转移所必需的。近期，科学家发现YTHDF1(YTHdomainfamilyprotein1，YTH结构域家族蛋1)作为m6A结合蛋白家族成员之一，在高原家养哺乳动物中低表达，而在正常肺上皮细胞中抑制其表达可以抵抗低氧诱导的细胞凋亡。深入研究发现，YTHDF1在非小细胞肺癌肿瘤组织和细胞系中均高表达，其在常氧条件下通过加速CDK2(Cyclin-dependentkinase2，细胞周期蛋白依赖激酶2)和CDK4等细胞周期蛋白的表达来促进肿瘤细胞的增殖；而在铂类药物为主的化疗压力环境下，由于YTHDF1高表达促进了Keap1(Kelch-likeECH-associatedprotein1，Kelch样环氧氯丙胺相关蛋白1)的表达，导致Nrf2(NF-E2-relatedfactor2，核因子E2相关因子2)转录因子的迅速降解和下游耐药基因AKR1C1(Aldo-KetoReductase1C1，醛酮还原酶1C1)的沉默，因此肿瘤患者对化疗更敏感且总生存时间更长。一旦海拔高度(氧气含量)高于(低于)动物最适生理范围时就会产生严重应激，进而影响其生产性能。越来越多的证据表明DNA甲基化修饰在动物高原低氧适应性过程中发挥重要调节作用，同样转录组层面的m6A甲基化修饰也响应于应激而改变。但是，现有的研究都是从转录组、基因组和蛋白质组水平进行研究，就现有的文献来看，m6A甲基化修饰在畜禽高原低氧适应性研究方面还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于MeRIP-Seq技术挖掘藏绵羊高原低氧适应性相关基因的方法。本专利技术是这样实现的，一种基于MeRIP-Seq技术挖掘藏绵羊高原低氧适应性相关基因的方法，该方法包括以下步骤：(1)对所提取的绵羊肺脏组织RNA依次进行RNA免疫沉淀、文库构建和测序；(2)对测序得到的原始数据进行质控过滤得到高质量数据，将该高质量数据与绵羊参考基因组比对得到具有唯一比对位置的数据，将该唯一比对位置的数据进行可视化分析；(3)根据上述唯一比对位置的数据中进行m6A甲基化修饰的peak鉴定和注释，得到peak相关基因；(4)对差异m6A甲基化修饰基因进行鉴定，对差异peak相关基因进行GO(Geneontology,基因本体)与KEGG(Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes,京都基因与基因组百科全书)功能富集分析；(5)根据所鉴定的结果，选择10个基因使用MeRIP-qPCR方法对MeRIP-Seq富集和测序结果进行验证。优选地，在步骤(2)中，对测序得到的原始数据通过FASTQ软件进行质控过滤得到高质量数据；将该高质量数据通过Bowtie2软件比对到绵羊的核糖体数据库中，通过Bowtie2软件去除比对上核糖体RNA的数据，将该数据比对到绵羊参考基因组上得到具有唯一比对位置的数据。优选地，步骤(3)包括以下具体步骤：3A、使用MACS2软件在全基因组范围内进行peak扫描(peakcalling)，阈值为Qvalue<0.05，其中，组内重复样本间的peak进行过滤，保留overlap>50％的共有peak进行后续分析；如果组内有两个生物学重复，则保留的peak必须在两个样本中都出现；如果组内有三个生物学重复，则保留的peak必须在至少两个样本中都出现；3B、使用DiffBind软件进行组间peak的合并，得到各个处理组间peak的并集，并计算各个peak在各个样本中的丰度，根据peak在基因组上的区域信息及基因的注释信息，得到peak相关基因。优选地，步骤(4)包括以下步骤：4A、利用MeRIP数据与Input数据，计算每个peak的相对甲基化率，然后用exomePeak软件对组间的所有peak进行RNA甲基化率差异分析，利用FDR值与log2FC(log2foldchange，log2差异倍数)来筛选差异peak，筛选条件为FDR<0.05且|log2FC|>1，对差异peak相关基因进行GO与KEGG功能富集分析；4B、使用DAVID数据库对差异peak关联的基因进行GO功能富集分析，利用超几何分布检验计算GO功能显著富集的p值，再对p值进行Benjamini&Hochberg多重检验纠正，FDR≤0.05(Falsediscoveryrate，错误发现率)的GOterms被认为显著富集，使用KEGG数据库对差异peak关联基因进行Pathway的功能注释和归类，KEGGpathway功能富集方法同GO分析。本专利技术克服现有技术的不足，提供一种基于MeRIP-Seq(MethylatedRNAImmunoprecipitation，RNA甲基化免疫共沉淀)技术挖掘藏绵羊高原低氧适应性相关基因的方法，本专利技术选择高低海拔绵羊(扎什加羊和湖羊)各3只并采集肺脏组织进行表观转录组测序，运用MeRIP-Seq和生物信息学方法来探索藏绵羊适应高原低氧的分子机制，寻找与藏绵羊高原低氧适应性相关的基因及调控通路，为藏绵羊生产和品种培育提供理论依据。相比于现有技术的缺点和不足，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术首次从表观遗传角度出发，将m6A甲基化修饰与藏绵羊高原低氧适应性联系起来，以挖掘与藏绵羊高原低氧适应性相关基因，为藏绵羊生产和品种培育提供重要的理论依据。附图说明图1是藏绵羊和湖羊m6Apeak保守基序分析，其中，图A藏绵羊经典的RRACH基序；图B是湖羊经典的RRACH基序；图C是藏绵羊最显著的基序；图D是湖羊最显著的基序；图2是m6Apeak相对基因组位置分布图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于MeRIP-Seq技术挖掘藏绵羊高原低氧适应性相关基因的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：/n(1)对所提取的绵羊肺脏组织RNA依次进行RNA免疫沉淀、文库构建和测序；/n(2)对测序得到的原始数据进行质控过滤得到高质量数据，将该高质量数据与绵羊参考基因组比对得到具有唯一比对位置的数据，将该唯一比对位置的数据进行可视化分析；/n(3)根据上述唯一比对位置的数据中进行m

【技术特征摘要】
1.一种基于MeRIP-Seq技术挖掘藏绵羊高原低氧适应性相关基因的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)对所提取的绵羊肺脏组织RNA依次进行RNA免疫沉淀、文库构建和测序；
(2)对测序得到的原始数据进行质控过滤得到高质量数据，将该高质量数据与绵羊参考基因组比对得到具有唯一比对位置的数据，将该唯一比对位置的数据进行可视化分析；
(3)根据上述唯一比对位置的数据中进行m6A甲基化修饰的peak鉴定和注释，得到peak相关基因；
(4)对差异m6A甲基化修饰基因进行鉴定，对差异peak相关基因进行GO与KEGG功能富集分析；
(5)根据所鉴定的结果，选择10个基因使用MeRIP-qPCR方法对MeRIP-Seq富集和测序结果进行验证。


2.如权利要求1所述的基于MeRIP-Seq技术挖掘藏绵羊高原低氧适应性相关基因的方法，其特征在于，在步骤(2)中，对测序得到的原始数据通过FASTQ软件进行质控过滤得到高质量数据；
将该高质量数据通过Bowtie2软件比对到绵羊的核糖体数据库中，通过Bowtie2软件去除比对上核糖体RNA的数据，将该数据比对到绵羊参考基因组上得到具有唯一比对位置的数据。


3.如权利要求1所述的基于MeRIP-Seq技术挖掘藏绵羊高原低氧适应性相关基因的方法，其特征在于，步骤(3)包括以下具体步骤：
3A、使用MACS2软件在全基因组范围内进行peak扫描(peakcalling)，...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢曾奎，杨博辉，刘建斌，袁超，岳耀敬，郭婷婷，牛春娥，李建烨，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62