BeSO制造技术

BeSO

【技术实现步骤摘要】
BeSO4染毒大鼠肺组织差异表达蛋白检测与分析方法
本专利技术涉及肺部疾病实验研究领域，特别是一种BeSO4染毒大鼠肺组织差异表达蛋白检测与分析方法。
技术介绍
铍(Beryllium，Be)是一种灰白色碱土金属，具有较高的熔点及较强的导电性和导热性，其主要以铍金属、铍合金和铍氧化物这三种形式使用，广泛用于航空航天、信息技术、医疗行业和核工业。铍早在1993年就被国际癌症研究机构列为Ⅰ类致癌物，暴露于铍化合物中可致急性铍病、铍致敏、慢性铍病、肺癌疾病。铍暴露(即暴露在含有铍化合物的环境中)会损伤全身多处脏器。而肺脏是铍损害的主要靶器官，铍对肺脏的损害可以引起呼吸系统炎症、肺组织肉芽肿及肺间质纤维化，造成肺组织的结构和功能损伤，形成“铍肺”。更加严重的问题是，在停止铍暴露多年后，铍仍会存在于个体的肺中，对肺脏形成持续的损害。目前，铍化合物致肺损伤的毒理机制尚未完全阐明，针对“铍肺”的治疗也仅是对症及支持治疗为主。因此，深入了解铍化合物致肺损伤的毒理机制对于防治“铍肺”显得尤为重要。
技术实现思路
<br>本专利技术的目本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.BeSO

【技术特征摘要】
1.BeSO4染毒大鼠肺组织差异表达蛋白检测与分析方法，其特征是：步骤如下：
S01、获取大鼠肺组织：
a、选10只健康的雄性大鼠，随机分为5只一组的对照组和5只一组的染毒组，分别正常喂水喂食饲养6周，染毒组在第2周滴注0.25ml的BeSO4溶液到大鼠气管中，对照组在第2周滴注0.25ml的灭菌超纯水到大鼠气管中；
b、染毒组和对照组共10只大鼠均用乙醚麻醉，再用腹主动脉采血法收集血液，待大鼠死亡后，分别取肺脏以待后续使用；
S02、样品制备：
a、每个肺脏分别称取50mg，分别剪碎,放入不同的无菌研钵体中，在每个无菌研钵体中加入300ul8Murea裂解液和3ul蛋白酶抑制剂；
b、将10个无菌研钵体中的肺组织分别置于研磨仪中研磨成肉糜，静置30min，使肺组织中的蛋白质充分发生裂解反应；
c、将10份样品分别收集到10个离心管中，分别进行离心处理，离心处理后，分别收集10个离心管中的上清液，上清液中含有肺组织中的蛋白质；
d、分别测定10份上清液中的蛋白质浓度，根据每份上清液的蛋白质浓度，在10份上清液中分别取含有150ug蛋白质的溶液量，转移到不同的超滤管的内管中；
S03、蛋白还原处理：
a、在10个超滤管的内管中分别加入浓度为10mM的DTT溶液，将各超滤管中的溶液量补足至500ul，再对各超滤管进行离心处理，离心处理后，丢弃超滤管外管中的滤出液；
b、重复b分步骤至少两次，使裂解液被DTT充分置换掉；
c、将10个超滤管置于37℃的孵育箱中1h，使超滤管内管中的蛋白质与DTT充分发生还原反应；
S04、蛋白烷基化处理：
a、在10个超滤管的内管中分别加入浓度为20mM的IAA溶液，将各超滤管中的溶液量补足至500ul；再对各超滤管进行离心处理，离心处理后，丢弃超滤管外管中的滤出液；
b、重复a步骤至少两次，使DTT被IAA充分置换掉；
c、将10个超滤管静置于37℃的孵育箱中避光静置1h，使超滤管内管中的蛋白质与IAA充分发生烷基化反应；
S05、蛋白酶解：
a、在10个超滤管的内管中分别加入浓度为100mM的TEAB溶液，将各超滤管中的溶液量补足至500ul；再对各超滤管进行离心处理，离心处理后，丢弃超滤管外管中的滤出液；
b、重复a步骤至少两次，使IAA被TEAB充分置换掉；
c、将10个超滤管内管中的溶液一一对应的转移至10个EP管中，分别添加胰蛋白酶至各EP管中，各EP管均于37℃的温度下进行酶解反应14-16h；
S06、对蛋白进行TMT标记：
使用TMT标签对酶解后的10个EP管内的溶液样品进行标记，每管样品使用一个标签，各EP管均置于37℃的孵育箱中进行标记反应1h，标记反应完成后，各EP管中分别加入8ul的5%质量浓度的羟胺溶液，静置15min，以终止标记反应；
S07、对样品进行LC-MS/MS检测：
a、将染毒组的5管样品混合为一管，命名为A管，将对照组的5管样品混合为一管，命名为B管，再分别对A管和B管内的溶液进行浓缩干燥，然后在A管和B管内分别加入200ul的0.1%FA溶解干燥浓缩后的样品，之后对A管和B管内的溶液分别进行分组分，各获得45管分馏样品，将所有的分馏样品浓缩蒸干以待后续试验使用；
b、将染毒组的45管浓缩蒸干样品分别命名为C1、C2、C3·····C45，在C1-C15号浓缩蒸干样品中分别加入20ul的0.1%FA进行溶解，然...

【专利技术属性】
技术研发人员：张朝晖，郑凯，刘艳萍，徐新云，蔡颖，雷媛娣，
申请(专利权)人：南华大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43