一种以hspa12b作为糖尿病治疗靶点的检测方法技术

本发明专利技术公开一种以hspa12b作为糖尿病治疗靶点的检测方法，检测包括hspa12b在小鼠饥饿后肝脏组织中的表达变化，hspa12b基因敲除小鼠糖耐量及丙酮酸耐量的改变，肝脏组织中糖异生相关基因PGC1α、pepck、G6pase表达变化。本发明专利技术检测方法通过提取饥饿小鼠肝脏组织的RNA检测hspa12b的表达水平；利用。操作简单快速、稳定性好；为糖尿病患者的临床诊治提供强有力的理论支持，具有临床意义和推广价值。

【技术实现步骤摘要】
一种以hspa12b作为糖尿病治疗靶点的检测方法
本专利技术涉及一种检测方法，具体是一种以hspa12b作为糖尿病治疗靶点的检测方法。
技术介绍
维持葡萄糖稳态是哺乳动物生存的基础。肝脏通过调节糖原分解与合成、糖异生等方式，在禁食期间维持正常血糖，在进食后储存葡萄糖。在禁食期间，肝脏作为维持血糖的主要器官，最初通过糖原分解来产生葡萄糖，然后通过糖异生将包括氨基酸、乳酸及丙酮酸在内的各种原料合成葡萄糖，而这些功能的异常，往往会使葡萄糖稳态受到影响，引起糖尿病等疾病。随着生活水平提高和社会老龄化，糖尿病的发病率迅速增长，流行病学研究结果显示，目前全球糖尿病患者已高达4.2亿例，严重危害人类健康。因此，寻找新的有效的蛋白分子作为糖尿病治疗的干预靶点具有重要意义。热休克蛋白(HSPs)是在几乎所有物种中均存在的进化上高度保守的蛋白质，作为分子伴侣在细胞周期调控、细胞信号转导、细胞结构维持等多种生命活动中发挥重要作用。HSP70是HSPs家族中最保守、含量最丰富、最重要的一类，正常情况下在细胞内呈基础表达，当机体受到有害刺激时，HSP70表达迅速增加，修复蛋白质损伤，抑制细胞损伤通路。糖尿病患者血清HSP70水平有明显升高。热休克蛋白A12B(HSPA12B)是HSP70家族的新成员。后续研究证实，HSPA12B参与调控内皮细胞的迁移、增殖和血管新生。内皮细胞损伤模型中，HSPA12B表达有明显升高，过表达HSPA12B可以通过抑制内皮细胞的炎症反应，减轻血管内皮功能损伤，发挥心血管保护作用。近期我们发现，野生型小鼠饥饿后肝脏组织中hspa12b表达升高；hspa12b基因敲除小鼠较野生型小鼠糖耐量血糖更低、生糖能力更弱，其肝脏组织中糖异生相关基因PGC1α、pepck、G6pase表达更低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种以hspa12b作为糖尿病治疗靶点的检测方法，检测包括hspa12b在小鼠饥饿后肝脏组织中的表达变化，hspa12b基因敲除小鼠糖耐量及丙酮酸耐量的改变及肝脏组织中糖异生相关基因PGC1α、pepck、G6pase表达变化。本专利技术检测方法通过提取饥饿小鼠肝脏组织的RNA检测hspa12b的表达水平；利用hspa12b敲基因小鼠检测敲基因小鼠葡萄糖耐受能力和生糖能力以及肝脏组织中糖异生相关基因PGC1α、pepck、G6pase的改变。操作简单快速、稳定性好；为糖尿病患者的临床诊治提供强有力的理论支持，具有临床意义和推广价值。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种以hspa12b作为糖尿病治疗靶点的检测方法，所述检测方法是检测hspa12b在小鼠饥饿后肝脏组织中的表达变化，hspa12b敲除小鼠糖耐量，丙酮酸耐量以及肝脏组织糖异生相关基因PGC1α、pepck、G6pase的改变。所述hspa12b在小鼠饥饿后肝脏组织中的表达变化的检测方法包括：A1、提取正常饮食和禁食的野生型小鼠肝脏组织；A2、提取肝脏组织总RNA；A3、RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR检测；A4、确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和溶解曲线，计算hspa12b的相对定量值。所述肝脏组织糖异生相关基因PGC1α、pepck、G6pase的改变的检测方法包括：D1、分别取hspa12b敲除小鼠和野生型小鼠肝脏组织；D2、hspa12b敲除小鼠；D3、提取肝脏组织总RNA；D4、RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR检测；D5、计算PGC1α、pepck、G6pase的相对定量值；D6、计算hspa12b敲除小鼠肝脏组织中糖异生相关基因PGC1α、pepck、G6pase与野生型小鼠肝脏组织中糖异生相关基因PGC1α、pepck、G6pase表达差异。进一步地，所述hspa12b敲除小鼠糖耐量检测方法包括：B1、小鼠称重后禁食；B2、向禁食小鼠腹腔内注射葡萄糖；B3、hspa12b敲除小鼠；B4、阶段性测小鼠血糖；B5、观察结果，对比分析。进一步地，所述丙酮酸耐量检测方法包括：C1、小鼠禁食；C2、向禁食小鼠腹腔注射丙酮酸；C3、hspa12b敲除小鼠；C4、阶段性测小鼠血糖；C5、观察结果，对比分析。进一步地，所述hspa12b在饥饿小鼠的肝脏组织中表达变化包括第一实时荧光定量PCR检测试剂，第一实时荧光定量PCR检测试剂包括hspa12b的特异性引物和内参照TBP的特异性引物。进一步地，所述hspa12b的特异性引物包括hspa12b的特异性正向引物和hspa12b的特异性反向引物。进一步地，所述hspa12b敲除小鼠肝脏组织糖异生相关基因PGC1α、pepck、G6pase表达变化包括第二实时荧光定量PCR检测试剂。进一步地，所述第二实时荧光定量PCR检测试剂包括PGC1α的特异性引物、pepck的特异性引物、G6pase的特异性引物和内参照TBP的特异性引物。进一步地，所述PGC1α的特异性引物包括PGC1α的特异性正向引物和PGC1α的特异性反向引物；pepck的特异性引物包括pepck的特异性正向引物和pepck的特异性反向引物；G6pase的特异性引物包括G6pase的特异性正向引物和G6pase的特异性反向引物。进一步地，所述内参照TBP的特异性引物包括TBP的特异性正向引物和TBP的特异性反向引物。本专利技术的有益效果：1、本专利技术检测方法通过从小鼠饥饿后肝脏组织中提取mRNA检测hspa12b表达变化，检测hspa12b基因敲除小鼠糖耐量及丙酮酸耐量及提取肝脏组织中mRNA检测糖异生相关基因PGC1α、pepck、G6pase表达变化，操作简单快速、稳定性好；2、本专利技术检测方法为糖尿病患者的临床诊治提供强有力的理论支持，具有临床意义和推广价值。附图说明下面结合附图对本专利技术作进一步的说明。图1是本专利技术hspa12b在小鼠饥饿后肝脏组织中的mRNA表达示意图；图2是本专利技术hspa12b基因敲除小鼠糖耐量试验示意图；图3是本专利技术hspa12b基因敲除小鼠糖耐量试验示意图；图4是本专利技术hspa12b基因敲除小鼠丙酮酸耐量试验示意图；图5是本专利技术hspa12b基因敲除小鼠丙酮酸耐量试验示意图；图6是本专利技术hspa12b基因敲除小鼠肝脏组织中糖异生相关基因PGC1α、pepck、G6pasemRNA表达示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1实时荧光定量PCR检测法发现hsp本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以hspa12b作为糖尿病治疗靶点的检测方法，其特征在于，所述检测方法是检测hspa12b在小鼠饥饿后肝脏组织中的表达变化，hspa12b敲除小鼠糖耐量，丙酮酸耐量以及肝脏组织糖异生相关基因PGC1α、pepck、G6pase的改变；/n所述hspa12b在小鼠饥饿后肝脏组织中的表达变化的检测方法包括：/nA1、提取正常饮食和禁食的野生型小鼠肝脏组织；/nA2、提取肝脏组织总RNA；/nA3、RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR检测；/nA4、确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和溶解曲线，计算hspa12b的相对定量值；/n所述肝脏组织糖异生相关基因PGC1α、pepck、G6pase的改变的检测方法包括：/nD1、分别取hspa12b敲除小鼠和野生型小鼠肝脏组织；/nD2、hspa12b敲除小鼠；/nD3、提取肝脏组织总RNA；/nD4、RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR检测；/nD5、计算PGC1α、pepck、G6pase的相对定量值；/nD6、计算hspa12b敲除小鼠肝脏组织中糖异生相关基因PGC1α、pepck、G6pase与野生型小鼠肝脏组织中糖异生相关基因PGC1α、pepck、G6pase表达差异。/n...

【技术特征摘要】
1.一种以hspa12b作为糖尿病治疗靶点的检测方法，其特征在于，所述检测方法是检测hspa12b在小鼠饥饿后肝脏组织中的表达变化，hspa12b敲除小鼠糖耐量，丙酮酸耐量以及肝脏组织糖异生相关基因PGC1α、pepck、G6pase的改变；
所述hspa12b在小鼠饥饿后肝脏组织中的表达变化的检测方法包括：
A1、提取正常饮食和禁食的野生型小鼠肝脏组织；
A2、提取肝脏组织总RNA；
A3、RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR检测；
A4、确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和溶解曲线，计算hspa12b的相对定量值；
所述肝脏组织糖异生相关基因PGC1α、pepck、G6pase的改变的检测方法包括：
D1、分别取hspa12b敲除小鼠和野生型小鼠肝脏组织；
D2、hspa12b敲除小鼠；
D3、提取肝脏组织总RNA；
D4、RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR检测；
D5、计算PGC1α、pepck、G6pase的相对定量值；
D6、计算hspa12b敲除小鼠肝脏组织中糖异生相关基因PGC1α、pepck、G6pase与野生型小鼠肝脏组织中糖异生相关基因PGC1α、pepck、G6pase表达差异。


2.根据权利要求书1所述的一种hspa12b作为糖尿病治疗靶点的检测方法，其特征在于，所述hspa12b敲除小鼠糖耐量检测方法包括：
B1、小鼠称重后禁食；
B2、向禁食小鼠腹腔内注射葡萄糖；
B3、hspa12b敲除小鼠；
B4、阶段性测小鼠血糖；
B5、观察结果，对比分析。


3.根据权利要求书1所述的一种hspa12b作为糖尿病治疗靶点的检测方法，其特征在于，所述丙酮酸耐量检测方法包括：
C1、小鼠禁食；
C2、向禁食小鼠腹腔注射...

【专利技术属性】
技术研发人员：高伟，鲁翔，沈茜煜，刘嘉莉，赵璨，张康振，
申请(专利权)人：南京医科大学附属逸夫医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32