HDAC5基因敲除的BHK-21细胞系及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了HDAC5基因敲除的BHK‑21细胞系的构建方法，利用CRISPR/Cas9技术对口蹄疫疫苗生产用细胞系BHK‑21中的HDAC5进行基因敲除，将用于敲除HDAC5的CRISPR质粒转染BHK‑21细胞后，利用抗生素筛选结合梯度稀释，用克隆环法分离到了多个细胞克隆。提取基因组DNA后进行PCR扩增、测序，成功鉴定到了1个HDAC5基因发生纯合移码突变的细胞克隆，其中HDAC5‑KO‑A2在Cas9预定切割位置处有13个碱基的缺失。HDAC5敲除的BHK‑21细胞系中口蹄病毒复制速率明显加快，最终病毒滴度有显著提高，且HDAC5敲除后对细胞生长速率无显著影响，说明其有用于口蹄疫疫苗生产的前景。为进一步在悬浮培养型BHK‑21细胞中敲除HDAC5，直接用于口蹄疫疫苗生产奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
HDAC5基因敲除的BHK-21细胞系及其构建方法和应用
本专利技术属于基因工程领域，特别涉及一种HDAC5基因敲除的BHK-21细胞系及其构建方法和应用。
技术介绍
口蹄疫(Foot-and-mouthdisease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)感染所引起的一种急性、热性、高度接触传染性疫病，主要感染猪、牛、羊等偶蹄动物。该病传播途径多、传播速度快，曾在世界范围内造成巨大经济损失，被世界动物卫生组织列为A类动物疫病之首。目前对于该病的防控以疫苗免疫预防为主，而且传统灭活疫苗仍占据市场主导地位。口蹄疫灭活疫苗的生产完全依赖口蹄疫病毒在幼仓鼠肾传代细胞BHK-21(Babyhamsterkidneycell)中的复制。BHK-21细胞最早由MacPherson和Stoker于1962年利用1日龄叙利亚仓鼠肾细胞建系。该细胞生长迅速、病毒敏感谱较广，随后被用于多种病毒的增殖及疫苗生产，如口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、新城疫疫苗等。原始的BHK-21细胞为贴壁生长型细胞，不利于商业化疫苗的大规模生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.HDAC5基因敲除的BHK-21细胞系的构建方法，其特征在于：根据NCBI中金仓鼠的HDAC5基因序列，利用CRISPOR软件在HDAC5的第1个外显子区域设计gRNA序列：CCCGTAGCGCAGGGTCCATG；设计好的gRNA，合成、退火并连接至PX459(Addgene#62988)质粒；测序正确的CRISPR质粒中抽备用；根据Invitrogen Lipofectamine 2000的标准转染程序，CRISPR质粒转染BHK-21细胞系，转染48h后加入终浓度3μg/mL的嘌呤霉素筛选5-7天后，进行细胞计数，分别铺100个和300个细胞，一周后单个细胞克隆形成后用克隆环挑取单克...

【技术特征摘要】
1.HDAC5基因敲除的BHK-21细胞系的构建方法，其特征在于：根据NCBI中金仓鼠的HDAC5基因序列，利用CRISPOR软件在HDAC5的第1个外显子区域设计gRNA序列：CCCGTAGCGCAGGGTCCATG；设计好的gRNA，合成、退火并连接至PX459(Addgene#62988)质粒；测序正确的CRISPR质粒中抽备用；根据InvitrogenLipofectamine2000的标准转染程序，CRISPR质粒转染BHK-21细胞系，转染48h后加入终浓度3μg/mL的嘌呤霉素筛选5-7天后，进行细胞计数，分别铺100个和300个细胞，一周后单个细胞克隆形成后用克隆环挑取单克隆，转移至24孔板，扩大培养；收集不同细胞克隆分别在DNA水平和蛋白水平进行鉴定。


2.根据权利要求1所述的HDAC5基因敲除的BHK-21细胞系的构建方法，其特征在于：所用细胞系为贴壁培养型BHK-21细胞系；细胞培养在5％CO2培养箱中，温度为37℃，DMEM培养基中添加有10％胎牛血清和1％抗生素(penicilin-streptomycin)。


3.根据权利要求1所述的HDAC5基因敲除的BHK-21细胞系的构建方法，其特征在于：DNA水平鉴定时用以下引物扩增：GT-FP(TTCTCCTTGTTGCGCAGGAT)，GT-RP(TGTCTGGTAGTCTCCTGGGC)，扩增产物进行Sanger测序；蛋白水平鉴定时用HDAC5的抗体(CST，20458)利用Westernblot检测HDAC5的蛋白表达水平。


4.根据权利要求1所述的HDAC5基因敲除的BHK-21细胞系的构建方法，其特征在于：得到HDAC5敲除细胞HDAC5-KO-A2，HDAC5-KO-A2在Cas9预定切割位置处有13个碱基的缺失，用Westernblot检测内源HDAC5的蛋白表达水平，HDAC5-KO-A2细胞系不能检测到HDAC5的蛋白表达。


5.权利要求1-4中任一项所述方法构建的HDAC5基因敲除的BHK-21细胞系。


6.权利要求5所述的HDAC5基因敲除的BHK-21细胞系中口蹄疫病毒的复制速率评价方法，其特征在于：
HDAC5敲除的BHK-21细胞系及对照细胞系(转染PX459空质粒的BHK-21细胞系)在60mm的细胞培养皿中培养到大约80％的汇合度时，吸掉培养基，加入2mLPBS洗两次细胞后吸干净PBS，加入1mLDMEM(对照)或稀释至MOI＝0.1的口蹄疫病毒，在培养箱中孵育1h，吸掉病毒液，加入2mLPBS洗两次细胞后吸干净PBS，加入3mLDMEM培养基；分别在感染不同时间收集上清及细胞样品，利用RT-qPCR、Westernblot、病毒滴度测定方法综合评价口蹄疫病毒的复制情况；
RT-qPCR检测病毒RNA的相对表达量：
收集的细胞样品利用Trizol法提取总RNA，测定浓度后利用PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(TaKaRa,RR047A)反转录试剂盒进行反转录，qPCR则是用SYBRGreenqPCRSuperMix(Takara)试剂完成；β-Actin作为内参基因，对VP...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙跃峰，龚青，侯石桐，赵帅阳，殷相平，王相伟，王光祥，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62