一种猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法，属于动物传染病防治和生物技术领域。本发明专利技术基于BAC系统和同源重组一步克隆法拯救PDCoV CHN‑HN‑2014株重组病毒的反向遗传系统，将毒株的5个基因片段一步克隆至中间载体pBAC‑M‑PDCoV中，获得包含PDCoV CHN‑HN‑2014株全长cDNA的重组质粒pBAC‑CHN‑HN‑2014，转染细胞后拯救出重组病毒rCHN‑HN‑2014，从而建立了猪δ冠状病毒反向遗传操作平台，为深入研究PDCoV的感染和致病机制奠定了基础。同时，针对目前我国还没有可用的PDCoV疫苗的实际问题，本发明专利技术的PDCoV感染性克隆平台，还可以用于研制更加安全高效的新型PDCoV基因工程疫苗，该平台还可作为活病毒载体，用于多联疫苗的研制，因此本发明专利技术对于该病毒相关的研究具有重大价值。

【技术实现步骤摘要】
一种猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法
本专利技术属于动物传染病防治和生物领域。具体涉及一种猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法。
技术介绍
猪δ冠状病毒(porcinedeltacoronavirus,PDCoV)属于冠状病毒科，δ冠状病毒属成员，有囊膜、基因组为单股正链RNA，是目前唯一一种成功分离的δ冠状病毒。Woo等人对中国香港地区2010-2011年采集自不同动物的样品进行冠状病毒检测时首次发现猪δ冠状病毒(WooP.C.Y,DiscoveryofsevennovelMammalianandaviancoronavirusesinthegenusdeltacoronavirussupportsbatcoronavirusesasthegenesourceofalphacoronavirusandbetacoronavirusandaviancoronavirusesasthegenesourceofgammacoronavirusanddeltacoronavirus.J.Virol.2012,86:3995-4008)。2014年本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法，其特征在于包括以下步骤：/n(1)提取猪δ冠状病毒RNA并反转录成cDNA；/n(2)以上述cDNA为模板，设计引物分别进行PCR扩增，获得猪δ冠状病毒的5’端基因序列、3’端基因序列以及5个基因片段，其中，所述5个基因片段之间含有20bp的同源序列，此外，将15121位点C沉默突变成A，消除了一个ClaI内切酶序列，作为遗传标记；/n(3)以pBAC-AJ1102质粒为模板，设计引物分别进行PCR扩增，获得CMV启动子和HDV-BGH基因序列；/n(4)利用BAC系统，通过ApaLI和HindIII限制性内切酶和多步融合PCR方法将CMV启动子、...

【技术特征摘要】
1.一种猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)提取猪δ冠状病毒RNA并反转录成cDNA；
(2)以上述cDNA为模板，设计引物分别进行PCR扩增，获得猪δ冠状病毒的5’端基因序列、3’端基因序列以及5个基因片段，其中，所述5个基因片段之间含有20bp的同源序列，此外，将15121位点C沉默突变成A，消除了一个ClaI内切酶序列，作为遗传标记；
(3)以pBAC-AJ1102质粒为模板，设计引物分别进行PCR扩增，获得CMV启动子和HDV-BGH基因序列；
(4)利用BAC系统，通过ApaLI和HindIII限制性内切酶和多步融合PCR方法将CMV启动子、5’端基因序列、3’端基因序列、27个腺嘌呤脱氧核苷酸(A)的poly(A)结构、丙肝病毒(HDV)核酶自切割位点以及牛生长激素终止序列(BGH)克隆至低拷贝载体pBeloBAC11中获得中间载体pBAC-M-PDCoV；
(5)将5个基因片段按比例同源重组一步克隆至中间载体pBAC-M-PDCoV中获得重组质粒pBAC-CHN-HN-2014；
(6)将重组产物转化至DH10B化学感受态细胞中，利用PCR筛选阳性克隆，将测序正确的阳性克隆扩大培养后提取质粒。


2.如权利要求1所述猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法，其特征在于：所述猪δ冠状病毒为CHN-HN-2014株。


3.如权利要求1所述猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法，其特征在于，所述5’端基因序列、3’端基因序列以及5个基因片段的序列分别为：
5’端基因序列：SEQIDNO:1；
3’端基因序列：SEQIDNO:2；
基因片段A：SEQIDNO:3；
基因片段B：SEQIDNO:4；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：方六荣，方谱县，肖少波，夏思进，任杰，张健淞，张慧畅，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42