一种猪卵巢GV期卵泡内颗粒细胞分离、原代培养和传代培养方法技术

本发明专利技术公开了一种猪卵巢GV期卵泡内颗粒细胞分离、原代培养和传代培养方法，所述方法包括采集无囊肿的健康的猪的卵巢，清洗卵巢；分离颗粒细胞；接着将颗粒细胞进行原代培养48h；原代培养的培养瓶换液；换液后继续培养36h，对培养后的细胞进行清洗、消化、终止；最后分装进行传代培养48h即可。本发明专利技术提供了一种无污染采集卵巢的方法，优化了颗粒细胞的获取及培养方法，还提供了原代颗粒细胞传代培养方法。使用本发明专利技术的方法获得的颗粒细胞几乎无污染，细胞均匀度高，所处的生长发育时期一致性高，细胞成活率高，制作氧化应激等模型成功率高，结果一致性高，实用性强，稳定性强，可行性高。此外，获得的细胞数量多，后续可供开展的实验多，减少去屠宰场的次数，效率高。

【技术实现步骤摘要】
一种猪卵巢GV期卵泡内颗粒细胞分离、原代培养和传代培养方法
本专利技术涉及细胞培养领域，具体涉及一种猪卵巢GV期卵泡内颗粒细胞分离、原代培养和传代培养方法。
技术介绍
颗粒细胞可以向卵母细胞提供营养物质，传递信号，促进卵母细胞的成熟，提高卵子的质量。卵泡闭锁是卵泡发育过程中正常的生理现象，但是，异常的卵泡闭锁将会降低可用卵泡的数目，减少排卵数，进而降低人的生殖功能和减少猪的产仔数。颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的主要原因，氧化应激能诱导猪卵巢颗粒细胞的凋亡。然而，目前，市场上还没有猪卵巢颗粒细胞细胞系，也没有正常的人卵巢颗粒细胞细胞系，猪又是人类比较适宜的实验动物模型。因此，在体采集猪卵巢颗粒细胞进行培养，是研究卵巢功能的重要技术基础。但现有技术中将猪卵巢颗粒细胞分离以后原代培养即已经出现细胞浑浊、细胞不贴壁等现象，更无法进行传代培养以进行后续的实验。
技术实现思路
为此，本专利技术提供一种猪卵巢GV期卵泡内颗粒细胞分离、原代培养和传代培养方法，以解决现有技术中猪卵巢颗粒细胞分离以后原代培养即已经出现细胞浑浊、细胞不本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪卵巢GV期卵泡内颗粒细胞分离、原代培养和传代培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/n步骤一，采集卵巢/n采集无囊肿的健康的猪的卵巢，清洗卵巢；/n步骤二，颗粒细胞沉淀的获取/n取8-9mL所述卵巢的细胞液于15mL离心管中，1000r离心5min，去上清液；加入2mLPBS缓冲液，吹打混匀，1000r离心5min，去上清液；再次加入2mLPBS缓冲液，吹打混匀，1000r离心5min，去上清液；最后加4mL全有培养基吹打混匀得颗粒细胞悬液；/n步骤三，原代培养/n取10μL所述颗粒细胞悬液稀释100倍后，在显微镜下进行细胞计数，以5×10

【技术特征摘要】
1.一种猪卵巢GV期卵泡内颗粒细胞分离、原代培养和传代培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤一，采集卵巢
采集无囊肿的健康的猪的卵巢，清洗卵巢；
步骤二，颗粒细胞沉淀的获取
取8-9mL所述卵巢的细胞液于15mL离心管中，1000r离心5min，去上清液；加入2mLPBS缓冲液，吹打混匀，1000r离心5min，去上清液；再次加入2mLPBS缓冲液，吹打混匀，1000r离心5min，去上清液；最后加4mL全有培养基吹打混匀得颗粒细胞悬液；
步骤三，原代培养
取10μL所述颗粒细胞悬液稀释100倍后，在显微镜下进行细胞计数，以5×108个/瓶接种到T25培养瓶中，向培养瓶中加入4mL全有培养基，吹打混匀，培养箱中培养，得原代培养细胞；
步骤四，原代培养培养液更换
培养48h后，去培养液，用2mLPBS缓冲液清洗贴壁细胞，去清洗液，加入3mL全有培养基，培养箱培养；
步骤五，传代培养
培养箱培养36h，贴壁率达70％～80％后，加入3mLPBS缓冲液清洗贴壁细胞1-2次，去清洗液；加入1～2mL胰酶，培养箱恒温消化2min；加入与胰酶等量的全有培养基终止胰酶反应，吹打混匀；转移至15mL离心管中，1000r离心5min，去上清液，加入1mL全有培养基，吹打混匀，在显微镜下进行细胞计数；以106个/瓶接种到T25培养瓶中，并加入3mL全有培养基，培养箱中培养；得传代培养细胞。


2.根据权利要求1所述猪卵巢GV期卵泡内颗粒细胞分离、原代培养和传代培养方法，其特征在于，所述步骤一中，所述清洗卵巢的方法为将卵巢用0.9％的生理盐水洗2次，75％的酒精洗1...

【专利技术属性】
技术研发人员：隋世燕，孔彩华，王钦，刘克娜，龚绍荣，
申请(专利权)人：大理大学，
类型：发明
国别省市：云南;53