一种半胱氨酸修饰的纳米核壳硅胶材料及制备与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种半胱氨酸功能化的亲水纳米核壳硅胶材料的制备及其在糖肽富集中的应用。具体合成路线是首先采用四丙氧基硅烷(Tetrapropoxysilane，TPOS)，甲醛(Formaldehyde)和间苯二酚(Resorcinal)在碱性催化条件下生成实心硅胶微球，再经过高温煅烧得到纳米级的核壳硅胶微球，进行乙烯基修饰后，采用光引发巯基‑烯点击反应将半胱氨酸键合到微球表面得到亲水化的纳米硅胶微球材料，最后将该材料应用于生物样品中糖肽的高效富集。该亲水纳米材料的制备过程简单、反应条件温和、原料价格低廉，所制备的材料可成功应用于样品中糖肽的高效富集。

【技术实现步骤摘要】
一种半胱氨酸修饰的纳米核壳硅胶材料及制备与应用
本专利技术涉及一种亲水相色谱固定相材料，具体是一种半胱氨酸修饰后的亲水性纳米核壳硅胶材料及其制备，以及其对生物样品中的糖肽的分离富集。
技术介绍
核壳硅胶微球，也称为薄壳硅胶微球，顾名思义是由实心“核”与多孔“壳”两部分组装而成。内部的实心核，除了增加传质速率，还能在一定程度上增加基质的机械稳定性；外部的壳层结构可以提供一定的孔隙率，使核壳具备一定的载样能力。该种结构能够缩短溶质分子在多孔壳层内部的传质路径来加快固-液两相之间的传质速率，从而实现快速高效的色谱分离。这种材料作为色谱填料的另一个优势是背压较低，与高压液相色谱仪具有更好的兼容性，是传统全多孔硅胶微球的理想替代者，因此受到了科研工作者的青睐。目前已经发展出了多种策略来制备核壳硅胶微球，如多层自组装法(文献1DongH,BrennanJ.D.Chem.Commun.,2011,47,1207-1209)、模板法(文献2、KangY,ShanW,WuJ,etc.Chem.mater.,2006,18,1861-1866)等，但是这些制备方法过程繁琐，需要多个制备步骤，制备周期较长。蛋白质糖基化是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰。糖蛋白参与许多重要的生命进程，如免疫应答、信息传递、细胞迁移等。糖蛋白上糖链的异常改变会使其所修饰的蛋白质结构和功能发生变化，甚至会导致某些疾病的发生，因此糖基化的异常已经成为某些肿瘤发生和发展的重要标志之一(文献1Palaniappan,K.K.,Bertozzi,C.R.Chem.Rev.2016,116,14277-14306；文献2OhtsuboK.,MarthJ.D.Cell,2006,126,855-867；文献3梁阿新,汤波,孙立权等.化学进展.2019,31,996-1006)。蛋白质的糖基化分析对其生物学功能及阐明相关疾病的致病机理具有重要意义。目前，蛋白质的糖基化分析通常是通过高效液相色谱(high-performanceliquidchromatography，HPLC)与质谱(Massspectrometry，MS)联用技术来实现。但由于复杂样品中糖肽丰度很低，在质谱分析中非糖肽信号对糖肽信号有明显的抑制作用，因此在进行质谱分析之前需要对样品中的糖肽进行有效的富集(文献4LuH.,ZhangY.,YangP.Natl.Sci.Rev.2016,3,345-364；文献5TakegawaY.,DeguchiK.,ItoH.,etc.J.Sep.Sci.2006,29,2533-2540)。经过科研工作者的不断努力，已经发展了一系列糖肽富集方法，主要包括肼化学反应法、硼酸化学反应法、凝集素亲和法和亲水作用色谱等。每种方法都有其自身的特点，其中亲水作用色谱(Hydrophilicinteractionliquidchromatography，HILIC)由于对糖肽可以进行无差别式富集，糖基化鉴定覆盖率高，而且易于与HPLC-MS联用等优点，受到了越来越多的关注。但目前亲水相互作用色谱法依然存在对糖肽选择性低的缺点，非糖肽不能被有效去除，影响了糖肽的质谱响应。因此，寻找和制备新型糖肽富集材料依然是研究人员的重点(文献6ChenZ.,HuangJ.,LiL.TrendsAnal.Chem.2019,118,880-892)。本专利采用“一锅”合成法与高温煅烧相结合的方法制备出了核壳性的纳米硅胶材料，并用半胱氨酸进行修饰后用于复杂样品中的糖肽高效富集，合成步骤少，效率高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种半胱氨酸修饰的核壳硅胶微球材料的制备及其应用，其可用于亲水色谱的固定相高效地完成对生物样品中糖肽的分离富集。为实现上述目的，可按如下步骤操作：1)纳米核壳硅胶材料的制备：首先取2～4mLTPOS和2～4mL20～30％(m％)的氨水放入烧瓶中，并加入50～70mL无水乙醇和20～30mL水，在室温下反应10～20min，再加入300～400mg间苯二酚和0.5～0.7mL甲醛，在室温下反应20～24h；将得到的材料用40～60％(v％)乙醇溶液洗涤2～4次，80～100℃真空干燥10～12h；将材料置于马弗炉中500～700℃下煅烧4～6h，得到纳米核壳硅胶材料。2)活化核壳硅胶：首先称取100～200mg核壳硅胶于容器中，加入10％～20％(v％)盐酸溶液，在80～100℃反应6～8h，反应结束后用水洗至中性，置于烘箱中80～100℃干燥10～12h，得到盐酸酸化的核壳硅胶，即活化核壳硅胶。3)乙烯基功能化的核壳硅胶材料的制备：将酸化的后的硅胶分散在30～50mL干燥甲苯中，再逐滴加入0.2～0.4mL二甲基乙烯基氯硅烷和0.2～0.4mL三乙胺，放入50～70℃的油浴中反应20～24h；反应结束后将产物用甲醇洗涤2～4次，60～80℃真空干燥10～12h，得到乙烯基功能化的核壳硅胶材料4)亲水性核壳硅胶材料的制备：然后将100～200mg半胱氨酸和30～50mg的光引发剂DMPA溶解在30mL40％～60％(v％)乙醇溶液中，配置成修饰液；将乙烯基功能化的核壳硅胶材料平铺于4～6cm表面皿中，加入10～20mL修饰液，使材料完全浸没于溶液之中；然后将表面皿置于紫外光照下曝光10～20min；取出后用移液枪将修饰液移除，用药勺轻轻搅动材料，然后继续添加10～20mL半胱氨酸修饰液。再次将表面皿置于紫外灯下(365nm)曝光10～20min；用40～60％(v％)乙醇溶液洗涤所得到的材料2～4次，80～100℃真空干燥10～12h，即可得到半胱氨酸修饰后的亲水核壳硅胶材料。所述半胱氨酸修饰的亲水性核壳硅胶材料可用生物样品中糖肽的选择性富集。本专利技术具有如下优点：(1)制备方法反应条件温和，易于操作；(2)原料成本低廉，适合于大尺度制备；(3)所制备材料对于复杂样品中的糖肽具有很好的富集效果。附图说明图1为实施例1核壳硅胶材料的制备示意图和半胱氨酸修饰核壳硅胶材料的路线图。图2为核壳硅胶材料的扫描电镜图和透射电镜图以及商品化的全多孔硅胶的扫描电镜图。图3为实施例1核壳硅胶材料的氮气吸附/脱附曲线和孔径分布图。图4为核壳硅胶材料和商品化的全多孔硅胶材料进行半胱氨酸修饰前后的接触角对比图。图5为半胱氨酸功能化的核壳硅胶材料和全多孔硅胶对免疫球蛋白(IgG)酶解液富集前后的质谱对比图。图6为实施例1中半胱氨酸功能化的核壳硅胶材料对人血清酶解液进行富集后的色谱分离图。具体实施方式实施例1半胱氨酸修饰亲水性核壳硅胶材料用于糖肽的分离富集。半胱氨酸修饰亲水性核壳硅胶材料的制备：1)纳米核壳硅胶微球的制备：首先将3.46mL四丙氧基硅烷、3mL25％(m％)的氨水、60mL无水乙醇和20mL水加入到100mL圆底烧瓶中，在室温下搅拌反应15min。然后加入400mg间苯二酚和0.56mL甲醛，室温下继续反应24本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种半胱氨酸功能化的亲水性纳米核壳硅胶材料，于核壳硅胶微球表面通过巯基-烯反应修饰半胱氨酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种半胱氨酸功能化的亲水性纳米核壳硅胶材料，于核壳硅胶微球表面通过巯基-烯反应修饰半胱氨酸。


2.按照权利要求1所述介孔核壳硅胶材料，其特征在于：其结构示意图如下：





3.一种权利要求1或2所述的亲水性纳米核壳硅胶材料的制备方法，其特征在于：是利用光引发巯基-烯点击反应将半胱氨酸接枝到乙烯基功能化的核壳硅胶微球表面；
首先，以TPOS、甲醛和间苯二酚为制备单体，以乙醇和水组成混合溶液为溶剂，在氨水的催化下发生水解和缩聚反应，生成纳米级别的双层实心硅胶微球，然后经过高温煅烧得到核壳硅胶微球；
接着利用盐酸酸化得到活化核壳硅胶，再利用二甲基乙烯基氯硅烷在微球表面引入乙烯基双键；最后采用光引发巯基-烯点击反应将半胱氨酸键合到硅胶表面上，以提高微球表面的亲水性，得到可用于糖肽富集的亲水性的核壳硅胶微球材料。


4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：可按如下步骤操作：
纳米核壳硅胶材料的制备：首先取2～4mLTPOS和2～4mL20～30％的氨水放入烧瓶中，并加入50～70mL无水乙醇和20～30mL水，在室温下反应10～20min，再加入300～400mg间苯二酚和0.5～0.7mL甲醛，在室温下继续反应20～24h；将得到的材料用40～60％(v％)乙醇溶液洗涤2～4次，80～100℃真空干燥10～12h；最后将材料置于马弗炉中500～700℃下煅烧4～6h，得到纳米核壳硅胶...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧俊杰，马淑娟，叶明亮，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21