利用区室化提高酵母菌中7-脱氢胆固醇产量的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用区室化提高酵母菌中7

【技术实现步骤摘要】
利用区室化提高酵母菌中7
‑
脱氢胆固醇产量的方法


[0001]本专利技术属于代谢工程
，尤其涉及一种利用区室化提高酵母菌中7
‑
脱氢胆固醇产量的方法。

技术介绍

[0002]7‑
脱氢胆固醇是一种具有高附加值的在甾醇，人体中合成的7
‑
脱氢胆固醇(7
‑
DHC)在皮肤组织中被阳光照射后直接转化为维生素D3。而维生素D3不仅是人体骨骼肌肉生长发育所必须脂溶性维生素，还能降低免疫系统紊乱和多种癌症的风险，对心血管疾病也有预防作用，维生素D的缺乏已经被公认为是一个全球性的健康问题，这也增加每年全球对维生素D3或其直接前体7
‑
DHC的需求量。7
‑
DHC是雄甾烯二酮和9α
‑
羟基雄甾
‑4‑
烯
‑
3,17
‑
二酮等甾醇药物合成的重要前体物质。7
‑
DHC不光在医药和临床有重要应用，它也是制备胆甾相液晶材料的重要原料，在显示制造等方面也有广发应用。
[0003]传统的7
‑
DHC制备方法采用化学合成法，主流的化学合成法主要有两种，第一种是以胆固醇醋酸酯为原料，经过7
‑
位的溴化，消除和水解反应合成7
‑
DHC。第二种是以胆固醇醋酸酯为原料，经过氧化，腙化、消除和水解反应合成7
‑
DHC。化学合成的方法中存在反应底物的选择性问题，能耗高，反应条件苛刻且污染严重，不利于可持续发展。微生物发酵生产7
‑
DHC的方法绿色环保可持续。
[0004]7‑
DHC的微生物发酵方法主要集中于菌株的筛选和分子改造方面，菌株筛选费时费力，需要进行大规模的筛选，即使筛选到生产7
‑
DHC的菌株，其初始产物浓度也是极低的，并且不利于后期的改造和工业化生产。分子改造方面主要集中于分支路径的消除，前体物质的供应，但极容易造成有毒中间产物的积累，不利于菌株的生长和生产。如中国专利CN107075551B、美国专利US2007/0204059A1、中国专利CN109154015A；其中中国专利CN109154015A在酵母中生产甾醇混合物，为了达到优先生产7
‑
DHC的效果，需要将ERG5和ERG6失活，降低或者消除ARE2和ARE1的活性，表达甾醇
△
24
‑
还原酶活性的异源酶，但是失活麦角固醇合成路径中的关键基因，必定会影响菌体生长，并造成酵母细胞中胞质中的中间产物积累及代谢失衡。
[0005]现有生产7
‑
DHC的技术主要集中在增强胞质的甲羟戊酸途径，敲除麦角甾醇合成路径中的ERG5和ERG6，实现酿酒酵母中7
‑
DHC的积累，但酿酒酵母中7
‑
DHC合成路径长，途径中关键的酶分布在不同的细胞器中，在整个合成过程中会造成酶到酶的转化效率低，底物在反应之前扩散损失，中间产物的积累对前期合成路径反馈抑制等突出性问题，使在酿酒酵母菌中生产7
‑
DHC的产量一直难以实现大的提升。

技术实现思路

[0006]为了解决目前酵母菌胞质中合成7
‑
DHC存在的乙酰辅酶A不足的问题，本专利技术通过利用过氧化酶体和线粒体中的乙酰辅酶A，将7
‑
DHC合成路径中的酶通过过氧化酶体和线粒体定位蛋白标签分别定位于线粒体和过氧化酶体中，这样使酵母菌不光能在胞质能合成重
要的7
‑
DHC，还能在过氧化酶体和线粒体中合成，达到了提高代谢途径中底物的转化效率，增加最终产物的储存空间，减少代谢途径中的反馈抑制，最终通过这种方法实现了在酵母菌中7
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DHC的产量为52.31mg/L。
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种利用区室化提高酵母菌中7
‑
脱氢胆固醇产量的方法，包括分别在酵母菌宿主的过氧化酶体和线粒体中，表达异源甾醇
△
24
‑
还原酶和
△‑
胆甾烯醇酶，并分别使用过氧化酶体定位标签和线粒体定位标签将7
‑
脱氢胆固醇合成路径中的酶定位在过氧化酶体和线粒体中表达。
[0008]进一步地，所述的甾醇
△
24
‑
还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]进一步地，所述的
△‑
胆甾烯醇酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]进一步地，7
‑
脱氢胆固醇合成路径中的酶为羟甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13、甲羟戊酸激酶ERG12、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMG1、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、二磷酸甲戊二酸酯脱羧酶MVD1、异戊烯基二磷酸δ
‑
异构酶IDI1、二磷酸法尼基转移酶ERG9、角鲨烯单加氧酶ERG1、羊毛甾醇合酶ERG7、固醇14α
‑
脱甲基酶ERG11、
△
14
‑
固醇还原酶ERG24、甲基固醇单加氧酶ERG25、固醇4α
‑
羧酸酯3
‑
脱氢酶ERG26、3
‑
酮类固醇还原酶ERG27、
△7‑
甾醇5
‑
去饱和酶ERG3、甾醇
△
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‑
还原酶DHCR24和
△‑
胆甾烯醇酶EBP。
[0011]进一步地，羟甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13的NCBI编号为XM_033912304.1、甲羟戊酸激酶ERG12的NCBI编号为XM_033912620.1、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMG1的NCBI编号为XM_033912352.1、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8的NCBI编号为NM_001182727.1、二磷酸甲戊二酸酯脱羧酶MVD1的NCBI编号为NM_001183220.1、异戊烯基二磷酸δ
‑
异构酶IDI1的NCBI编号为NM_001183931.1、二磷酸法尼基转移酶ERG9的NCBI编号为NM_001179321.1、角鲨烯单加氧酶ERG1的NCBI编号为NM_001181304.1、羊毛甾醇合酶ERG7的NCBI编号为NM_001179202.2、固醇14α
‑
脱甲基酶ERG11的NCBI编号为NM_001179137.1、
△
14
‑
固醇还原酶ERG24的NCBI编号为NM_001183118.1、甲基固醇单加氧酶ERG25的NCBI编号为NM_001181189.3、固醇4α
‑
羧酸酯3
‑
脱氢酶ERG26的NCBI编号为NM_001180866.1、3
‑
酮类固醇还原酶ERG27的NC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用区室化提高酵母菌中7
‑
脱氢胆固醇产量的方法，其特征在于，包括分别在酵母菌宿主的过氧化酶体和线粒体中，表达异源甾醇
△
24
‑
还原酶和
△‑
胆甾烯醇酶，并分别使用过氧化酶体定位标签和线粒体定位标签将7
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脱氢胆固醇合成路径中的酶定位在过氧化酶体和线粒体中表达。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甾醇
△
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‑
还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的
△‑
胆甾烯醇酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，7
‑
脱氢胆固醇合成路径中的酶为羟甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13、甲羟戊酸激酶ERG12、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMG1、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、二磷酸甲戊二酸酯脱羧酶MVD1、异戊烯基二磷酸δ
‑
异构酶IDI1、二磷酸法尼基转移酶ERG9、角鲨烯单加氧酶ERG1、羊毛甾醇合酶ERG7、固醇14α
‑
脱甲基酶ERG11、
△
14
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固醇还原酶ERG24、甲基固醇单加氧酶ERG25、固醇4α
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羧酸酯3
‑
脱氢酶ERG26、3
‑
酮类固醇还原酶ERG27、
△7‑
甾醇5
‑
去饱和酶ERG3、甾醇
△
24
‑
还原酶DHCR24和
△‑
胆甾烯醇酶EBP。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，羟甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13的NCBI编号为XM_033912304.1、甲羟戊酸激酶ERG12的NCBI编号为XM_033912620.1、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMG1的NCBI编号为XM_033912352.1、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8的NCBI编号为NM_001182727.1、二磷酸甲戊二酸酯脱羧酶MVD1的NCBI编号为NM_001...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈坚，吕雪芹，堵国成，李江华，刘延峰，修翔，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：