一种确定与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列的方法和其应用技术

本发明专利技术公开了一种确定与目的蛋白互作的下游转录因子的方法及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术提供的方法通过BioID富集来源于目的蛋白表达体系的蛋白样本中生物素化的蛋白及与其交联的DNA片段，进而对富集的生物素化蛋白进行鉴定和定量，并结合ChIP

【技术实现步骤摘要】
一种确定与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列的方法和其应用


[0001]本专利技术属于生物
中下游转录因子的富集和鉴定的方法，具体涉及一种确定与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列的方法和其应用，尤其涉及一种结合利用BioID和ChIP
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Seq快速富集、鉴定、定量和筛选激酶下游弱的、瞬时互作的转录因子及其DNA结合序列的方法，及其在筛选对与目的蛋白相关的生物学通路起到激活或抑制作用的药物中的应用。

技术介绍

[0002]转录因子是指能够结合在某基因上游特异核苷酸序列上的蛋白质，这些蛋白质能调控其基因的转录。从本质上来讲，转录因子具有DNA序列的识别、结合以及控制基因表达的基本机能，这一机能可以单独或者通过与其它蛋白质形成复合体来完成。人类基因组中大约有1500个基因控制转录因子的编码。然而，转录因子在细胞内的表达丰度极低(仅占细胞总蛋白的0.01
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0.001％)，使得对转录因子的纯化及鉴定非常困难，如通过传统色谱方法进行转录因子的纯化通常需要抽提成百升细胞培养物，通过10,000<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种确定与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列的方法，包括富集、鉴定、定量和筛选的过程，具体包括以下步骤：1)利用过表达体系过表达目的蛋白，和野生型表达所述目的蛋白；2)利用过表达的目的蛋白进行生物素化处理和ChIP交联制备第一蛋白样本，利用野生型表达的目的蛋白进行生物素化处理和ChIP交联制备第二蛋白样本；3)使用链霉亲和素磁珠富集第一蛋白样本中生物素化的蛋白及与其交联的DNA片段，作为第一样本；使用链霉亲和素磁珠富集第二蛋白样本中生物素化的蛋白及与其交联的DNA片段，作为第二样本；4)使用LC
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MS/MS分别对步骤3)的第一样本和第二样本中的生物素化的蛋白进行转录因子的鉴定和定量；5)比较步骤4)中获得的第一样本中的转录因子和第二样本中的转录因子的定量数据，从中筛选出定量数据具有显著差异的转录因子作为与目的蛋白互作的下游转录因子；6)分别对步骤3)的第一样本和第二样本中的与生物素化的蛋白交联的DNA片段进行测序、文库比对和丰度检测；7)比较步骤6)中获得的第一样本和第二样本中的DNA片段的丰度，从中筛选出丰度具有显著差异的DNA片段作为步骤5)中筛选出的与目的蛋白互作的下游转录因子的DNA结合序列。2.根据权利要求1所述的方法，还包括由以下T1)
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T5)组成的第一验证步骤：T1)利用药物刺激所述过表达体系，表达获得经药物刺激后的目的蛋白；所述药物对与所述目的蛋白相关的生物学通路具有激活或抑制作用；T2)利用经药物刺激后的目的蛋白进行生物素化处理和ChIP交联制备第三蛋白样本；T3)使用链霉亲和素磁珠富集第三蛋白样本中生物素化的蛋白，作为第三样本；T4)使用LC
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MS/MS对第三样本中的生物素化的蛋白进行转录因子的鉴定和定量；T5)从步骤T4)中获得的第三样本中的转录因子中选取由步骤5)筛选出的下游转录因子，将其定量数据与步骤4)中获得的第一样本中的转录因子的定量数据比较，定量数据具有显著差异的转录因子经验证确定为与目的蛋白互作的下游转录因子。3.根据权利要求1所述的方法，还包括由以下S1)
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S5)组成的第二验证步骤：S1)利用药物刺激所述过表达体系，表达获得经药物刺激后的目的蛋白；所述药物对与所述目的蛋白相关的生物学通路具有激活或抑制作用；S2)利用经药物刺激后的目的蛋白进行生物素化处理和ChIP交联制备第四蛋白样本；S3)使用链霉亲和素磁珠富集第四蛋白样本中与生物素化的蛋白交联的DNA片段，作为第四样本；S4)对所述第四样本中的DNA片段进行测序、文库比对和丰度检测；S5)从步骤S4)中获得的第四样本中的DNA片段中选取由步骤7)筛选出的DNA结合序列，将其丰度与步骤6)中获得的第一样本中的DNA片段的丰度比较，丰度具有显著差异的DNA片段经验证确定为与目的蛋白互作的下游转录因子的DNA结合序列。4.根据权利要求1或2或3所述的方法，所述第一蛋白样本、第二蛋白样本、第三蛋白样本和第四蛋白样本来源于全细胞蛋白。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的方法，其中所述目的蛋白为IKKB激酶；与IKKB激酶
互作的下游转录因子为NFKB1、NFKB2、REL、RELA、STAT1、STAT3、STAT5B、CSDE1、NR3C1和TFCP2。6.一种确定与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列的方法，包括富集、鉴定、定量和筛选的过程，具体包括以下步骤：P1)利用药物刺激过表达体系表达获得经药物刺激后的目的蛋白，利用未经药物刺激过表达体系表达获得未经药物刺激的目的蛋白；所述药物对与所述目的蛋白相关的生物学通路具有激活或抑制作用；P2)利用P1)的经药物刺激后的目的蛋白和未经药物刺激的目的蛋白分别进行生物素化处理和ChIP交联制备第七蛋白样本和第八蛋白样本；P3)使用链霉亲和素磁珠富集第七蛋白样本中生物素化的蛋白及与其交联的DNA片段，作为第七样本；使用链霉亲和素磁珠富集第八...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁琛，田莎，刘洋，秦兆宇，杨冰，吴晓晖，姚珍梅，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：