乙型肝炎病毒复制抑制剂和包含该抑制剂的乙型肝炎治疗用药物组合物制造技术

开发并提供与以往的乙型肝炎治疗剂作用机制或目标对象不同的新的乙型肝炎治疗剂。提供由乙型肝炎病毒的核心蛋白质中的刺突区域、或包含编码该刺突区域的核酸的表达载体构成的乙型肝炎病毒复制抑制剂。的乙型肝炎病毒复制抑制剂。的乙型肝炎病毒复制抑制剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】乙型肝炎病毒复制抑制剂和包含该抑制剂的乙型肝炎治疗用药物组合物


[0001]本专利技术涉及乙型肝炎病毒复制抑制剂以及包含该乙型肝炎病毒复制抑制剂作为有效成分的乙型肝炎治疗用药物组合物。

技术介绍

[0002]乙型肝炎是通过乙型肝炎病毒(hepatitis B virus：在本说明书中，经常表述为“HBV”)的感染而发作的病毒性肝炎。乙型肝炎由于经由HBV感染者的血液、体液进行传播，因此在生产时经由HBV感染者的母亲的血液而其孩子感染的垂直感染(母婴感染)、由于性接触、刺青、输血、大规模预防接种中注射器的反复使用、针刺事故等导致的水平感染作为主要感染途径是已知的(非专利文献1)。
[0003]HBV感染大致分为一过性感染和持续感染。5岁以上的感染由于免疫能力充分发达，因此多数为一过性感染。其70～80％为隐性感染，其余20～30％发作急性乙型肝炎。然而，在大部分情况下，HBs抗体被诱导，因此获得终生免疫，不会转移为持续感染。另一方面，在母婴感染、在自身的免疫体系未成熟的3岁以下的时期由于医疗行为、家族内感染等原因而感染了HBV的情况下，持续感染能够成立。HBV的持续感染患者大部分作为维持正常的肝功能的“HBV携带者”而经过，其中的85～90％发生血清转化而成为无症状携带者。然而，其余10～15％发作慢性肝炎，进展为肝硬化、肝细胞癌。推算HBV的持续感染者数在日本为150万人，此外在全世界为3～4亿人(非专利文献2)。
[0004]现在，在慢性乙型肝炎的治疗药中，通用以拉米夫定(Lamivudine)、恩替卡韦(Entecavir)为代表的核酸类似物制剂。这些治疗药通过对HBV DNA聚合酶的竞争性拮抗作用和HBV DNA的延伸停止作用而使血中HBV量减少，从而可以延迟肝硬化、肝细胞癌的发生、进行。然而，由于不能排除肝细胞内的HBV DNA，因此如果中止药剂的施与则血中HBV DNA再上升而肝炎复发。因此需要治疗药的长期施与。此外，使用了上述核酸类似物制剂的长期治疗时的复发伴随耐药性病毒的出现。其使慢性乙型肝炎治疗更加困难(非专利文献3和4)。由于上述理由，期望开发与以往的核酸类似物制剂作用机制不同的新的乙型肝炎治疗药。
[0005]现有技术文献
[0006]非专利文献
[0007]非专利文献1：Aspinall E.J.et al.,2011,Occup Med(Lond),61:531
‑
540.
[0008]非专利文献2：Fattovich G.,et al.,2008,J Hepatol,48:335
‑
352.
[0009]非专利文献3：Lau D.T.et al.,2000,Hepatology,32:828
‑
834.
[0010]非专利文献4：Koumbi L.,2015,World J Hepatol,7:1030
‑
1040.

技术实现思路

[0011]专利技术所要解决的课题
[0012]本专利技术开发并提供与以往的乙型肝炎治疗剂作用机制或目标对象不同的新的乙
型肝炎治疗剂。
[0013]用于解决课题的方法
[0014]为了解决上述课题，本专利技术者们尝试了抑制HBV复制的新的乙型肝炎治疗剂的开发。
[0015]HBV是DNA病毒，其基因组如图1所示那样由正链((+)链)相对于负链((
‑
)链)短、因此一部分具有单链结构的约3.2Kb的环状不完全双链DNA(relaxed circular DNA：rcDNA)构成。在HBV基因组上，存在C、P、S和X的4种基因(Arzumanyan A,et al.,2013,Nat Rev Cancer.,13:123
‑
135)。C基因的ORF(可读框，open reading frame)(C
‑
ORF)是HBV的核衣壳的主成分，编码HBV的复制所需要的核心蛋白质(HBc)和HBe抗原，此外P基因的ORF(P
‑
ORF)编码逆转录酶(HBV
‑
Pol)。进而，S基因的ORF(S
‑
ORF)编码构成包膜的3种S蛋白质区域(preS1、preS2、和S)，此外X基因的ORF(X
‑
ORF)是转录调控因子，编码认为对肝细胞癌的成立而言重要的X蛋白质(HBx)。
[0016]HBV的感染和复制机制是，首先HBV经由HBV特异性的未知受体而侵入到作为宿主的肝细胞内，进行感染。感染后，在宿主细胞的核内通过来源于宿主细胞的内源性DNA聚合酶而修复单链部分，成为完全双链DNA(covalently closed circular DNA：cccDNA)。接着，以该cccDNA的(
‑
)链作为模板，通过来源于宿主细胞的RNA聚合酶II(RNA pol II)，合成长度不同的4种(3.5kb、2.4kb、2.1kb、和0.7kb)mRNA。其中最长的3.5kb mRNA被称为前基因组RNA(pgRNA)，成为HBV基因组DNA的模板。在pgRNA的5
’
和3
’
两末端存在的RNA衣壳化信号epsilon(ε)与HBV
‑
Pol相互作用，引入到通过HBc而构成的核衣壳中(Beck J,&Nassal M.,2007,World J Gastroenterol.,13:48
‑
64)。接着，以pgRNA作为模板，通过逆转录酶活性而合成负链DNA。在该基因组复制的过程中，需要pgRNA与HBV
‑
Pol一起被引入到核衣壳中。这些HBV的感染和复制机制提示，HBc是形成病毒颗粒的骨干的核衣壳的主成分，同时是在基因组复制中也发挥必需作用的极其重要的蛋白质。
[0017]因此，本专利技术者们着眼于HBc作为抑制HBV的复制的新的乙型肝炎治疗剂的目标蛋白质，尝试了能够拮抗地抑制HBV的复制的突变型HBc的制作。
[0018]另外，为了验证上述HBV的复制抑制，需要能够准确地定量、评价HBV复制的实验体系。虽然迄今为止存在多个分析HBV感染、HBV复制的评价体系，但都从使用具有感染性的HBV这点考虑具有安全方面、难以处理大量试样这样的问题。此外，在现阶段能够使HBV有效率地感染的细胞限于人肝细胞原代培养体系、或昂贵的HepaRG(注册商标)细胞，能够使用的细胞具有大的限制。进而，即使是使被认为是HBV的受体的NTCP超表达了的细胞，虽然感染成立但是感染效率也非常低，即使使用插入了HBV的基因组的确立细胞株(HepG2.2.15，HepAD38等)，到复制的检测为止也需要7～12天这样的长时间的培养。因此，在以往的HBV复制评价体系中具有缺乏通量性这样的大问题。
[0019]本专利技术者们在WO2018/030534中为了解决上述课题而构建了能够不使用具有感染性的HBV，使用一般的细胞，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种乙型肝炎病毒复制抑制剂，由以下(1)～(3)中的任一者构成，(1)构成乙型肝炎病毒的核心蛋白质中的刺突区域的肽片段，(2)在所述刺突区域的N末端和/或C末端添加了与所述核心蛋白质不同的任意氨基酸序列的肽片段，(3)包含编码所述(1)或(2)所记载的肽片段的核酸、并能够在细胞内表达所述肽片段的表达载体。2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒复制抑制剂，构成所述刺突区域的肽片段由以下(a)～(c)中的任一氨基酸序列构成，(a)序列号1～7所示的任一氨基酸序列，(b)在序列号1～7所示的任一氨基酸序列中添加、缺失或替换了1个或多个氨基酸的氨基酸序列，(c)与序列号1～7所示的任一氨基酸序列具有82％以上的氨基酸同一性的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒复制抑制剂，所述核酸由以下(i)～(iv)中的任一碱基序列构成，(i)序列号8～14所示的任一碱基序列，(ii)在序列号8～14所示的任一碱基序列中添加、缺失或替换了1个或多个碱基的碱基序列，(iii)与序列号8～14所示的任一碱基序列具有80％以上的碱基同一性的碱基序列，(iv)与序列号8～14所示的任一碱基序列的互补碱基序列在高严格的条件下杂交的碱基序列。4.根据权利要求2所述的乙型肝炎病毒复制抑制剂，其中，在序列号1～6所示的任一氨基酸序列中，23位的苯丙氨酸(F)残基被替换成丙氨酸(A)残基，和/或42位...

【专利技术属性】
技术研发人员：小川健司，
申请(专利权)人：国立研究开发法人理化学研究所，
类型：发明
国别省市：