一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法技术

本发明专利技术提出了一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法，包括以下步骤：(1)制备抗原：根据SARS

【技术实现步骤摘要】
一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法。

技术介绍

[0002]由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型引起的新型冠状病毒肺炎于2019年底出现并呈现全球爆发，严重危害人类健康和公共卫生安全，给世界社会和经济带来巨大负担，已引发全球范围内的高度关注。许多国内外学者推测新冠病毒或将类似于流感病毒，与人类长期共存。而且现有的研究报道和数据表明SARS
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CoV
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2的致死率远高于流感，然而到目前为止还没有专门针对抗新型冠状病毒的特效药，这就必须增强我们自身的免疫力，积极预防和抵抗新冠病毒的传播。
[0003]美国耶鲁大学的科学家们宣布研制成功世界上第一种人工合成抗体，它们可以吸附在致病细胞体上并帮助触发人体对病原的免疫反应。这种机制模仿了天然抗体的行为，后者同样会吸附到血液中致病细胞和细菌的表面，并引导白细胞对其进行攻击。科学家们表示他们此次研制的人工抗体可以在室温条件下存储，其将为治疗一些严重的疾病，如癌症，提供一种崭新而便捷的治疗方案。
[0004]本专利技术在人工合成抗体的基础上结合多克隆抗体制备工艺，通过提高牛奶中的新冠病毒特异性免疫球蛋白含量并保持大部分活性，使人体获得抵抗和预防新冠病毒的免疫力，从而在一定程度上降低新冠病毒的传播率，甚至提高新冠病毒引起的肺炎的治愈率。

技术实现思路

[0005]本专利技术提出含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法，解决了现有技术中多克隆抗体中特异性抗体含量低以及牛奶在灭菌过程中活性免疫球蛋白遇热变性的问题。
[0006]本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0007]一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法，包括以下步骤：
[0008](1)制备抗原：根据SARS
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COV
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2S蛋白的基因序列采用酵母菌重组抗原的方法制备纯化新冠病毒抗原；
[0009](2)将步骤(1)制备出的S蛋白重组抗原按1：1的体积比例加入完全弗氏佐剂，置入高速匀浆器中，以8000rpm高速匀化，形成油包水液体，即制得免疫用抗原；
[0010](3)将步骤(2)制备出的免疫用抗原对SPF奶牛进行免疫；每次免疫20天后，分别检测提取免疫奶牛所产牛奶，并进行编码标记，最终特异性免疫球蛋白经ELISA检测含量超过5mg/ml后开始收集牛奶；
[0011](4)将步骤(3)制得的含抗新冠病毒抗体的牛奶添加活性免疫球蛋白复合热变性保护剂，所述活性免疫球蛋白复合热变性保护剂是由甘氨酸、蔗糖、甘露醇按照3.5:2:5的质量比例混合而成，然后将含有所述保护剂的牛奶进行75℃，5min的杀菌处理并灌装冷藏保存。
[0012]可选地，步骤(1)中所述制备抗原，包括以下步骤：
[0013]1)筛选S蛋白抗原高蛋白表达的重组酵母菌株；
[0014]2)发酵生产S蛋白抗原；
[0015]3)纯化抗原。
[0016]可选地，所述筛选S蛋白抗原高蛋白表达的重组酵母菌株，包括以下步骤：
[0017]1)构建用于表达S蛋白抗原的载体；
[0018]2)将所述构建的载体转化入酵母菌株中，并在质粒转化时添加抗生素，筛选出高纯度蛋白表达菌株。
[0019]可选地，所述发酵生产S蛋白抗原，包括如下步骤：
[0020]1)甘油流加阶段：当溶氧快速上升时，表明发酵液中的碳源耗尽，开始补加甘油，甘油流加速率为2.0～10.0g/min，当湿菌重升至250～300g/L，停止甘油流加，待溶氧再次上升半小时后，开始甲醇诱导；保持较低的甘油浓度既能满足菌体生物量的增长，也能够解阻遏MOX启动子，使得代谢相关的酶类得到表达；
[0021]2)甲醇诱导阶段：调整pH至5.0，温度30℃，通气量15.0～35.0L/min，控制溶氧在20％以上，罐压为0.5bar，通过甲醇电极控制甲醇浓度为4.5～8.5g/L，能够防止甲醇过量导致的反馈抑制，同时防止甲醇浓度不足导致的蛋白表达量过低；甲醇诱导时间为40～60h，既能增加抗原表达量，同时减少多聚体的产生，增加抗原的稳定性。可选地，甲醇浓度控制在4.5～8.3g/L。可选地，甲醇浓度控制在4.6～5.8g/L。可选地，甲醇浓度控制在5.0～6.5g/L。
[0022]可选地，所述载体的外源基因表达框使用的MOX启动子序列、AOX1终止子序列、ARS(自主复制序列)在宿主表达细胞中(ATCC 26012)无完全相同序列，表达载体上的“MOX启动子
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外源基因
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AOX终止子”表达框能有效降低对宿主细胞当中的“MOX启动子
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MOX基因
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MOX终止子”进行同源替换的可能性，从而降低MOX基因被外源基因插入破坏的概率。
[0023]可选地，所述甘油流加阶段之前还包括甘油初培养阶段，所述甘油初培养阶段使用BSM无机盐培养基，调整pH至5.0，温度37℃，通气量15.0～35.0L/min，控制溶氧大于40％，罐压为0.5bar；所述BSM无机盐包括：0.90g/L CaSO4·
2H2O、11.67g/L MgSO4
·
7H2O、14.67g/L K2SO4、9.00g/L(NH4)2SO4、50g/L甘油和25.05g/L六偏磷酸钠。
[0024]可选地，所述甘油初培养阶段之前还包括将所述重组酵母菌株制成种子液。
[0025]可选地，所述抗原纯化阶段，包括如下步骤：
[0026]1)菌体破碎：取发酵得到的含有S蛋白抗原的酵母菌株，用25～100mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲液重悬，向悬液中加入终浓度2～5mM的EDTA、0.3％～0.7％的Tween 20及2～5mM的苯甲基磺酰氟(PMSF)，使用高压匀浆机破碎细胞，得匀浆液；
[0027]2)澄清：向所述匀浆液中加入终浓度为0.1～0.5M的NaCl及终浓度3％～7％的聚乙二醇6000(PEG6000)进行澄清，得澄清后的上清液；
[0028]3)硅胶吸附/解吸附：将所述上清液经硅胶吸附/解吸附以初步去除宿主杂质；
[0029]4)离子交换层析：将经硅胶吸附/解吸附所得的洗脱液经离子交换层析后得以进一步去除宿主核酸和杂蛋白，所述离子交换层析为SepharoseDEAE FF、Sepharose Q FF或Capto Q；
[0030]5)超滤浓缩：将经离子交换层析的洗脱液进行超滤浓缩，得浓缩液；
[0031]6)超速离心：将经超滤浓缩获得的浓缩液进行溴化钾等密度梯度离心，得到颗粒
密度更加均一的抗原成分，并获得离心液；
[0032]7)分子筛层析：将经超速离心获得的离心液进行分子筛层析，所述分子筛层析树脂为Sepharose 4FF，所得洗脱液即为抗原原液。
[0033]可选地，在所述硅胶吸附/解吸附步骤中，用25mM，pH 7本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备抗原：根据SARS
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COV
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2S蛋白的基因序列采用酵母菌重组抗原的方法制备纯化新冠病毒抗原；(2)将步骤(1)制备出的S蛋白重组抗原按1：1的体积比例加入完全弗氏佐剂，置入高速匀浆器中，以8000rpm高速匀化，形成油包水液体，即得免疫用抗原；(3)将步骤(2)制备出的免疫用抗原对SPF奶牛进行免疫；每次免疫20天后，分别检测提取免疫奶牛所产牛奶，并进行编码标记，最终特异性免疫球蛋白经ELISA检测含量超过5mg/ml后开始收集牛奶，即为含抗新冠病毒抗体的牛奶；(4)将步骤(3)制得的含抗新冠病毒抗体的牛奶添加活性免疫球蛋白复合热变性保护剂，所述活性免疫球蛋白复合热变性保护剂是由甘氨酸、蔗糖、甘露醇按照3.5：2：5的质量比例混合而成，然后将含有所述保护剂的牛奶进行75℃，5min的杀菌处理并灌装冷藏保存。2.根据权利要求1所述的一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述制备抗原，包括以下步骤：1)筛选S蛋白抗原高蛋白表达的重组酵母菌株；2)发酵生产S蛋白抗原；3)纯化抗原。3.根据权利要求2所述的一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法，其特征在于，所述筛选S蛋白抗原高蛋白表达的重组酵母菌株，包括以下步骤：1)构建用于表达S蛋白抗原的载体；2)将所述载体转化入酵母菌株中，并在质粒转化时添加抗生素，筛选出高蛋白表达菌株。4.根据权利要求2所述的一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法，其特征在于，所述发酵生产S蛋白抗原，包括如下步骤：1)甘油流加阶段：当溶氧快速上升时，甘油流加速率为2.0～10.0g/min，当湿菌重升至250～300g/L，停止甘油流加，待溶氧再次上升半小时后，开始甲醇诱导；2)甲醇诱导阶段：调整pH至5.0，温度30℃，通气量15.0～35.0L/min，控制溶氧在20％以上，罐压为0.5bar，通过甲醇电极控制甲醇浓度为4.5～8.5g/L，诱导时间为40～60h。5.根据权利要求4所述的一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法，其特征在于，所述甘油流加阶段之前还包括甘油初培养阶段，所述甘油初培养阶段使用BSM无...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵峰，
申请(专利权)人：青岛今墨堂生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：