巯基改性透明质酸及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及一种巯基改性透明质酸化合物及其制备方法和应用，本发明专利技术的巯基改性透明质酸的硫醇含量高、主链分子的分子量变化小，具有显著提高的粘度、保水性和抗氧化性能。本发明专利技术使用丙烯酰类化合物修饰的透明质酸与多巯基化合物通过硫醇与共轭双键的迈克尔加成反应来制备所述化合物，该制备方法能够灵活有效地控制合成产物的结构、组成、大量化合物分子末端功能基团的种类与含量等；采用生物相容性高的试剂，有效控制生产成本并降低合成工艺过程中的毒性；能够保证在采用安全性试剂和简单反应步骤的条件下，获得原材料结构和生物活性保持良好、功能基团种类和含量可按需调控的可作为细胞外基质材料巯基改性透明质酸，满足多种临床应用要求。种临床应用要求。种临床应用要求。

【技术实现步骤摘要】
巯基改性透明质酸及其制备方法和用途


[0001]本专利技术属于生物材料领域，具体涉及一种巯基改性透明质酸及其制备方法和用途。

技术介绍

[0002]生物相容性高分子具有很多重要的生理功能，常见的生物相容性高分子包括：多糖、蛋白质以及合成性高分子等，透明质酸是一种具有代表性的生物相容性高分子。
[0003]透明质酸(Hyaluronic acid，HA)，1934年，Karl Mayer教授首次从牛眼玻璃体中提取获得天然透明质酸，天然透明质酸是由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡糖胺的交替结构组成的天然杂多糖。其后经过数十年的研究，人们发现其在人和其他脊椎动物的结缔组织中广泛存在，例如细胞间隙、运动关节组织、脐带、皮肤、软骨、血管壁、滑液以及鸡冠等组织和器官中都含有透明质酸。透明质酸属于线性高分子多糖，结构中含有二糖重复单元，重复单元中的D-葡萄糖醛酸通过β-1,3糖苷键与N-乙酰基-D-葡糖胺连接，成千上万的二糖重复单元通过β-1,4糖苷键相连，形成整个高分子直链、线性结构。HA的链长度从约200kDa到约10MDa之间不等，最常见的大小范围为从2MDa到5MDa。超过50％的HA存在于皮肤、肺和肠组织中。此外，在关节滑液、软骨、脐带、血管壁等组织间质中也有存在。人体内HA主要发挥润滑及缓冲作用、填充和扩散屏障、以及清除自由基等生理功能。目前市场上所用的HA产品可以从动物组织中提取，如鸡冠、眼玻璃体、脑软骨、关节液等，也可由细菌发酵而制备，如链球菌、绿脓杆菌等。
[0004]近年来，随着对HA的深入研究，HA已广泛应用于医药领域，如用于制备药物传递系统，用于骨科疾病和眼科疾病的治疗、手术后粘连的预防及软组织修复等，HA的应用已成为组织工程与再生医学领域的研究热点。
[0005]尽管天然HA具有极好的生物相容性和抗炎等作用，天然HA存在较弱的机械强度以及易降解性。因此作为组织工程支架材料，HA必须经过适当的化学改性或与其他材料搭配使用，以改善这些不足，更好地发挥其生物作用，为细胞的存活和功能及组织的修复和再生提供良好的环境。HA可通过分子间物理作用，如氢键、静电作用、疏水作用及链间缠结等进行暂时性物理交联，此过程为可逆交联。未经修饰的HA很难具有协同作用，不能形成稳定的水凝胶。高浓度高分子量的未修饰HA可形成凝胶状溶液，但不存在化学交联。此类凝胶不需额外交联剂，但凝胶力学性能差，体内代谢快，不能满足多数组织工程学的应用要求。
[0006]易降解的天然HA可通过化学改性获得较好的物理稳定性和机械强度。HA的化学交联一般可通过小分子交联剂实现HA分子内或分子间交联，也可通过对HA进行化学修饰，引入反应性官能团后来实现交联。HA分子结构中有大量的伯、仲羟基以及羧基等基团，因此，可以用双官能团小分子交联剂对其进行交联，如环氧化合物、戊二醛、二乙烯基砜、多功能酰肼类化合物等。此外，HA分子侧链上的基团经过化学修饰可获得功能化HA，如醛基化HA、酰肼化HA、硫醇化HA(即巯基化HA)、双键化HA等。功能化HA通过自身进行交联或与其他成份交联，可获得一类具有优良力学性能和降解性能的水凝胶。HA也可与其他成分的生物功能
材料搭配使用，相互取长补短，从而获得具有优良性质的三维支架材料。
[0007]其中，巯基化HA因其特有的化学性质，十分适合抗氧化保健品、生物医药、医疗美容整形以及化妆品等领域的应用。
[0008]现有的巯基化HA的制备，主要有以下方法：
[0009]Prestwich与舒晓正等人首次报道了二硫代二酰肼法合成的巯基透明质酸衍生物，以下简称HA-SH，结构见图1(文献1：Biomacromolecules 2002，3，1304和公开号为CN101511875A的专利文献)。该方法需要通过多步反应预先合成含有二硫键的二酰肼化合物，并且反应过程中使用的试剂毒性比较高，例如水合肼就属于高毒性化合物，其大鼠经口口服的LD
50
为129mg/kg。随后通过与EDCI，即碳化二亚胺脱水剂，缩合反应使透明质酸与二硫代二酰肼化合物交联形成凝胶，该步骤由于反应体系整体凝胶化，无法持续搅拌以维持pH4.75的最佳反应条件，因此不易得到均一化的巯基衍生物。所得凝胶经过二硫苏糖醇还原反应得到巯基修饰的透明质酸衍生物。
[0010]Prestwich等人于2008年报道了一种硫代环乙烷修饰合成HA-SH的方法，具体见图2(文献2：Biomaterials2008，29，1388)。该方法不需要预先合成修饰试剂，但是受限于透明质酸伯醇的低反应活性，其修饰比例比较低。
[0011]2007年，Shimobouji等人报道了一种涉及二酰肼和Traut
’
s试剂的两步修饰法合成HA-SH，具体见图3(文献3：J Biomed Mater Res A.2007，80，916.)。该方法第一步使用过量的二酰肼化合物来修饰透明质酸，中间产品经过透析冻干等纯化步骤得到酰肼修饰的透明质酸衍生物。第二步使用Traut
’
s试剂来修饰酰肼透明质酸衍生物，经过一系列纯化操作得到巯基修饰的透明质酸衍生物。该反应第二步所用Traut
’
s试剂价格昂贵，参考价为：374€/g，Sigma公司，纯度98％。这极大地阻碍了该方法的大规模工业化生产。
[0012]2007年，Tae Gwan Park等人报道了一种使用光胺修饰的方法合成HA-SH，具体见图4(文献4：Journal of Controlled Release 2007，119，245)。该方法与二硫代二酰肼法类似，使用含有二硫键的光胺作为修饰原料，通过EDCI脱水缩合，二硫苏糖醇还原二硫键，最终得到HA-SH衍生物。由于氨基反应活性低于酰肼反应活性，因此该方法取代度低于二硫代二酰肼法合成的HA-SH。
[0013]2012年，C.Yan等人报道了使用β-巯基乙胺来修饰透明质酸合成HA-SH的方法，具体见图5(文献5：Acta Biomaterialia 2012，8，3643)。该方法直接使用含有硫醇的小分子化合物来修饰透明质酸的羧基，反应过程对硫醇基团不采取保护措施。由于硫醇同样可以和羧基发生EDCI催化偶联反应，因此该方法所得产品实际为巯基和胺基修饰透明质酸的混合物，并且硫醇取代度远远低于酰肼法合成的HA-SH。
[0014]2015年，Andreas Bernkop-Schunrch等人报道了一种使用半胱氨酸乙酯的方法合成HA-SH，具体见图6(文献6：International Journal of Pharmaceutics 2015，478，383)。该方法与β-巯基乙胺法类似，在反应过程中的硫醇也会参与羧基偶联反应，取代效率无法有效提高。
[0015]公开号为CN101200504A的专利文献中披露了一种使用改性二硫代二酰肼化合物修饰透明质酸的HA-SH合成方法，具体见图7。该方法所使用改性二硫代二酰肼化合物拥有更长的骨架结构，因此所得HA-SH中巯基的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种巯基改性透明质酸化合物，其特征在于，所述透明质酸的重复单元的侧链上含有的-COOH和/或-OH部分或全部被修饰形成端基为下述基团的侧链：上述基团中，*表示连接点；R1选自氢，卤素，脂肪基团，芳香基团等；R2和R3相同或不同，彼此独立地选自氢，卤素，脂肪基团，芳香基团等；R4为多巯基化合物片段。2.根据权利要求1所述的巯基改性透明质酸化合物，其特征在于，所述端基通过R基团与-COOH和/或-OH相连或直接与-COOH和/或-OH相连形成以下结构的至少一种的侧链：上述a结构、b结构、c结构和d结构中，R选自亚烃基、亚芳基、酰胺残基、酰肼残基等；*表示连接点；1*表示与R的左侧基团的连接点；2*表示与R的右侧基团的连接点；R1、R2、R3和R4的定义同前。3.根据权利要求1或2所述的巯基改性透明质酸化合物，其特征在于，所述巯基改性透明质酸包括如下结构的至少一种：
上述结构中，R、R1、R2、R3和R4的定义同前；(n2+n3)/(n1+n2+n3)表示丙烯酰化度；n3/(n1+n2+n3)表示巯基化程度，与上述的用Ellman法检测的所述巯基改性高分子化合物的巯基含量是对应的；所述n1可以为0，若为0，则不用限定丙烯酰化度，仅是n3/(n2+n3)表示巯基化程度，与上述的用Ellman法检测的所述巯基改性高分子化合物的巯基含量是对应的；所述n2可以为0，若为0，则n3/(n1+n3)既表示丙烯酰化度，又表示巯基化程度，与上述的用Ellman发检测的所述巯基改性高分子化合物的巯基含量是对应的；所述A1是：所述A2是下述结构中的一种：
A1和A2的结构中的*表示与COOH或OH的连接点。4.根据权利要求1-3任一项所述的巯基改性透明质酸化合物，其特征在于，R4为多巯基化合物片段，即-S-R
4-SH片段可由下述但不仅限于下述多巯基化合物引入：其中，n4＝2-30的整数，例如n＝2、3、4、5或6等；n5＝1-30的整数，例如为1、2、3、4、5等；n6＝1-30的整数，例如为1、2、3、4、5等；4-arm-PEG-S...

【专利技术属性】
技术研发人员：王文新，
申请(专利权)人：孛朗孚有限公司，
类型：发明
国别省市：