一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法，包括：

【技术实现步骤摘要】
一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及脐带间充质干细胞诱导技术，尤其是一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法。

技术介绍

[0002]随着我国人民生活日益富足人口老龄化问题凸显，越来越多的老年人患上神经损伤疾病，例如帕金森症、阿尔茨海默症还有脑血栓等局部神经损伤和凋亡的疾病。目前临床上仍无有效的治疗方法用于改善患者的神经功能缺陷，只能缓解症状或者延缓病情的加重。实验证明神经干细胞移植能够改善神经元损伤性疾病的恢复。
[0003]目前神经干细胞主要从胚胎干细胞诱导或是直接从发育中和成年哺乳动物的中枢神经系统中分离培养获得。但是伦理学、安全性问题以及细胞来源和数量均有限,在一定程度上都限制了神经干细胞的移植应用。因此,很有必要寻找其它能够获得神经干细胞的途径来克服这些限制。
[0004]有研究表明脐带被发现可以作为间充质干细胞的理想来源,将脐带诱导神经干细胞，但是脐带间充质干细胞诱导成神经干细胞诱导率低，并且成功率也低，诱导的神经干细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法，其特征在于：具体方法步骤如下：
⑴
取第3代人脐带间充质干细胞，以3000密度接种于培养瓶上；
⑵
用DF12、2％血清，双抗共培养24小时，24小时后流式检测；
⑶
用含2％血清、2％B27、DF12、20ng/mL EGF、20ng/mL BFGF、10uM Forskolin、1mM IBMX、35ng/mL dbcAMP共培养3天，诱导成神经干细胞，之后添加分化因子；
⑷
培养三天后使用免疫荧光和荧光定量PCR检测Nestin、PAX6、SOX1、SOX2四种神经干细胞的标志物的表达；
⑸
五天后使用免疫荧光技术和荧光定量PCR技术检测神经胶质细胞标志物GFAP和神经元标志物MAP
‑
2的表达。2.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法，其特征在于：所述的第3代人脐带间充质干细胞是原代培养到第三代使用或市售复苏使用。3.根据权利要求2所述的一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法，其特征在于：复苏方法为：将人脐带间充质干细胞从液氮罐拿出，37℃无菌水复苏，放入DF12培养基里，培养基与细胞悬液比例为9：1，300G，5min，重悬，细胞计数，接种于培养瓶内。4.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法，其特征在于：所述的分化因子分别是20ng/mL EGF、20ng/mL BFGF、10uM Forskolin、10ng/mL BDNF、50ng/mL IGF
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1、5uM/LRA、200uM/LBHA，使神经干细胞分化成神经胶质细胞和神经元。5.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法，其特征在于：免疫荧光方法步骤如下：
⑴
3次用PBS浸洗细胞，每次3min；
⑵
用4％的多聚甲醛固定细胞15min，PBS浸洗载玻片3次，每次3min；
⑶
PBS配制0.5％Triton X
‑
100室温通透处理20min；
⑷
PBS浸洗载玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在载玻片上滴加山羊血清，室温封闭30min；
⑸
吸水纸吸掉封闭液，滴加稀释好的一抗，稀释倍数为100倍，并放入湿盒，4℃孵育过夜；
⑹
24h后，加荧光二抗：PBS浸洗3次，每次3min，滴加稀释好的荧光二抗，稀释100...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯郸，马洁，楼敏铭，崔瑛，
申请(专利权)人：天津市康婷生物工程集团有限公司，
类型：发明
国别省市：