一种检测猪源性成分的引物对和探针及其试剂盒和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测猪源性成分的引物对和探针，并公开了根据该引物对和探针设计的试剂盒，该试剂盒包括RAA反应体系和LFD试纸条；所述RAA反应体系包括RAA反应通用干粉、Tris‑HCl缓冲液、上游引物ZHU‑F、下游引物ZHU‑R、探针ZHU‑PRO、样品DNA提取液、MgAcO、ddH

【技术实现步骤摘要】
一种检测猪源性成分的引物对和探针及其试剂盒和应用
本专利技术涉及一种检测猪源性成分的引物对和探针及其试剂盒和应用，属于生物技术和食品安全快速检测领域，特别涉及一种基于重组酶介导等温核酸扩增技术-侧流免疫技术检测猪源性成分的引物对和探针及其试剂盒和应用。
技术介绍
肉类和肉制品被认为是人体蛋白质的重要来源，并已进化为一种基本的饮食成分，因其令人欣赏的味道和风味在世界各地被广泛消费。由于经济利润的诱惑(经济动机的掺假，EMA)，不道德的生产者可能会尝试用猪肉来替代牛肉、羊肉和其他昂贵的肉类。全球都发生了肉类掺假事件。2013年发生在英国和欧洲的马肉丑闻(即所谓的“马门”丑闻)是最著名的食品欺诈和污染事件之一，它证明了目前复杂的国际食品供应链中固有的脆弱性。肉类掺假直接威胁消费者的健康，削弱加工企业的信誉，破坏贸易秩序和公平竞争。因此，为了保护消费者的权益，避免不公平的市场竞争，提供一种可靠、高效、快速、准确的方法，能够准确地从肉制品中鉴别出动物种类，防止肉品变味的情况，势在必行。目前，几种分析方法已被验证和开发用于筛选和监测肉类掺假，如光谱分析、电泳、酶联免疫吸附试验(ELISA)、色谱分析等。应用最广泛的方法是聚合酶链反应(PCR)，包括常规PCR、实时PCR、引物多重PCR、PCR-rflp、高分辨率熔融(HRM)分析、PCR-测序等。然而，现有的技术需要相当多的操作技能，昂贵的设备和漫长的过程，这些条件或资源局限都限制了食品肉类的检测应用。近年新发展起来的核酸等温扩增技术，主要有核酸依赖性扩增检测技术(Nuclearacidsequence-basedamplification，NASBA)、环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)、依赖解旋酶DNA恒温扩增技术(Helicase-dependentIsothermalDNAAmplification，HDA)、滚环核酸扩增技术(rollingcircleamplification，RCA)、重组酶聚合酶扩增技术(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)、重组酶介导等温核酸扩增技术(RecombinaseAidedAmplification，RAA)等。其基本原理均是模仿体内核酸复制机制，由各种蛋白酶参与反应，帮助DNA聚合酶复制DNA，以实现DNA的等温扩增。与PCR相比，等温扩增技术使得核酸在恒温条件下得以扩增，摆脱了昂贵的热循环实验仪器，并且可在短时间内实现目的片段的指数扩增，使在多种非实验室条件下进行核酸扩增检测成为现实。重组酶辅助扩增联合侧流免疫技术(RecombinaseAssistedAmplification-LateralFlowDevice，RAA-LFD)，即将重组酶辅助扩增技术(RAA)结合侧向流动免疫技术(LFD)的一种联用技术。我们拟基于RAA-LFD技术，构建一种适合于检测现场(超市、肉市场等)对肉品掺假快速检测的方法。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术目的是提供一种检测猪源性成分的扩增引物对和探针。本专利技术另一目的是根据扩增引物对和探针提供一种基于重组酶介导等温核酸扩增技术-侧流免疫技术检测猪源性成分的试剂盒。本专利技术另一目的是提供基于重组酶介导等温核酸扩增技术-侧流免疫技术检测猪源性成分的试剂盒的应用。该试剂盒及其检测方法简便快速、适合于现场检测猪源性成分，对操作人员的技术要求、设备要求较低，适合现场快速检测，在食品安全的快速检测中有广阔的应用前景。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供一种检测猪源性成分的扩增引物对和探针，序列分别如下：上游引物ZHU-F：CACTCGCATTAACAATCACC，如SEQIDNO:1所示；下游引物ZHU-R：FITC-GGTGTATTTTGGTAGCACGGA，如SEQIDNO:2所示；探针ZHU-PRO：BIOTIN–CACTAGCTCTATGTATATGACACATCTCACTC-(H)-CTATTATAACAGCAAG-PHO，如SEQIDNO:3所示；其中，FITC为荧光基团；BIOTIN为生物素；H为四氢呋喃位点；PHO为磷酸化修饰。该探针序列中插入一个dSpacer四氢呋喃(THF)来模拟一个基本位点进行修饰位点，THF修饰核苷酸在DNA聚合酶的作用下，可以高效地实现DNA链的延伸。本专利技术提供根据如上所述检测猪源性成分的扩增引物对和探针设计的试剂盒，所述试剂盒包括RAA反应体系和LFD试纸条，所述LFD试纸条的检测线上带有生物素抗体和荧光基团抗体，质控线上带有亲和素-胶体金特异性抗体。进一步地，所述荧光基团抗体为FAM抗体的纳米金粒。将带有生物素标记、6-羧基荧光激素FAM标记的引物和探针与靶核酸进行扩增反应，产物为同时带有生物素和FAM标记的扩增子。LFD试纸条前端是靠近浸液区的检测线，靠近手持端吸液区即后端是质控线。LFD试纸条前端检测线带有FAM抗体的纳米金粒，检测线上还带有生物素抗体，将扩增产物滴到试纸条上，扩增子上的FAM基团与FAM抗体反应，检测线处的生物素抗体与扩增子上的生物素结合后，检测线上显示条带，未被捕获的产物与质控线处的亲和素-胶体金特异性抗体结合显示条带。FAM标记也可根据需要选择合适的其他标记，如地高辛标记进行应用。检测线与质控线条带颜色，根据胶体金粒径和还原剂选择的改变，肉眼所看到颜色会有改变，但不影响检测结果，可根据需要选择合适的胶体金粒径和还原剂。进一步地，所述RAA反应体系包括在RAA反应通用干粉中加入以下体积比组成：更进一步地，所述RAA反应体系中，所述RAA反应通用干粉的加入量为1μg/10～30μL；所述RAA反应通用干粉中包括有：重组酶，BstDNA聚合酶，SSB蛋白，修复酶，dNTPs。所述RAA反应通用干粉为RAA基础通用反应试剂冻干粉。例如江苏奇天基因生物科技有限公司产品，每管2μg冻干粉，反应规格为50μL，即每50μL反应体系加入RAA基础通用反应试剂冻干粉2μg。本领域技术人员可以根据需要选择合适的RAA基础通用反应试剂产品进行应用。更进一步地，所述Tris-HCl缓冲液浓度为300mM，pH＝8.0。更进一步地，所述上游引物ZHU-F的浓度为10μM；下游引物ZHU-R的浓度为10μM；探针ZHU-PRO的浓度为10μM。更进一步地，所述MgAcO的浓度为280mM，加入量为体积百分比5.6％。更进一步地，该试剂盒反应条件为37～42℃条件下反应15～25min。更进一步地，该试剂盒还包括有阳性对照；所述阳性对照为根据猪的ND1基因的序列，合成标靶区域的质粒。更进一步地，所述阳性对照的制备包括以下步骤：根据NCBI中猪的ND1基因的序列，以猪源性成分检测用引物对上游引物ZHU-F、下游引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测猪源性成分的引物对和探针，其特征在于，序列分别如下：/n上游引物ZHU-F：CACTCGCATTAACAATCACC，如SEQ ID NO:1所示；/n下游引物ZHU-R：FITC-GGTGTATTTTGGTAGCACGGA，如SEQ ID NO:2所示；/n探针ZHU-PRO：/nBIOTIN–CACTAGCTCTATGTATATGACACATCTCACTC-(H)-CTATTATAACAGCAAG-PHO，如SEQ IDNO:3所示；/n其中，FITC为荧光基团；BIOTIN为生物素；H为四氢呋喃位点；PHO为磷酸化修饰。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测猪源性成分的引物对和探针，其特征在于，序列分别如下：
上游引物ZHU-F：CACTCGCATTAACAATCACC，如SEQIDNO:1所示；
下游引物ZHU-R：FITC-GGTGTATTTTGGTAGCACGGA，如SEQIDNO:2所示；
探针ZHU-PRO：
BIOTIN–CACTAGCTCTATGTATATGACACATCTCACTC-(H)-CTATTATAACAGCAAG-PHO，如SEQIDNO:3所示；
其中，FITC为荧光基团；BIOTIN为生物素；H为四氢呋喃位点；PHO为磷酸化修饰。


2.一种根据权利要求1所述检测猪源性成分的引物对和探针设计的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括RAA反应体系和LFD试纸条；所述LFD试纸条的检测线上带有生物素抗体和荧光基团抗体，质控线上带有亲和素-胶体金特异性抗体。


3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述RAA反应体系包括在RAA反应通用干粉中加入以下体积比组成：





4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述RAA反应体系中，所述RAA反应通用干粉的加入量为1μg/10～30μL；所述RAA反应通用干粉中包括有：重组酶，BstDNA聚合酶，SSB蛋白，修复酶，dNTPs。


5.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述MgAcO的浓度为280mM，加入量为体积百分比5.6％。


6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒反应条件为37～42℃条件下反应15～25min。


7.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括有阳性对照；所述阳性对照为根据猪的ND1基因的序列，合成标靶区域的质粒。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：林丽云，林敏，刘谋泉，王忠合，庄沛锐，陈楚锐，郑玉忠，杨培奎，黄慧莹，
申请(专利权)人：韩山师范学院，
类型：发明
国别省市：广东;44