一种受体拮抗剂长效性分析方法技术

本发明专利技术公开了一种受体拮抗剂长效性分析方法，属于受体拮抗剂长效性分析方法领域。之前受体拮抗剂长效性评价主要通过放射性配体的竞争性结合试验来确认，但此方法存在一定的局限性，如需要洗涤和过滤，实验周期长及通量低。本发明专利技术基于无标记细胞整合药理学技术，无需放射性标记，降低试验难度，有效的缩短试验周期，提高试验效率。本发明专利技术中的方法评价的化合物噻托溴铵和雷芬那辛均为M3受体长效拮抗剂，格隆溴铵为M3受体中长效拮抗剂，异丙托溴铵为M3受体短效拮抗剂，这一结果与放射性标记方法的结论一致。本发明专利技术提到的受体拮抗剂长效性分析新方法具有检测结果可靠、灵敏度高、筛选通量高及操作简便等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种受体拮抗剂长效性分析方法
本专利技术涉及长效性分析方法
，具体涉及一种受体拮抗剂长效性分析方法领域。
技术介绍
G蛋白偶联受体(G-protein-coupledreceptor,GPCR)是细胞信号传导中最重要的一类膜受体，也是小分子药物开发中最受关注的药物靶点之一，约34％的现代药物直接靶向该受体家族。目前确定的M受体有5种亚型，即M1～M5，其中M1、M2和M3受体存在于人类肺脏，与COPD的发生发展密切相关。其中M3主要表达于气道平滑肌细胞、黏膜下腺体、肺血管中。M3在肺部呼吸道平滑肌的量虽然很少，但M3可联合M1主要通过Gq蛋白作用于磷脂酸肌醇系统激活磷脂酶C，生成IP3和DAG，增加细胞质中的Ca2+水平，导致支气管平滑肌收缩。气道平滑肌细胞上分布有高密度的KCA通道，平滑肌细胞收缩时，胞质内Ca2+浓度升高可激活该通道，K+外流使细胞复极化，平滑肌舒张。该通道是舒张的重要环节。M3在黏膜下腺体，调控气道水、黏液和电解质的分泌，也能开放肺泡上皮钠通道，增加肺泡上皮液体转运。在肺血管，当迷走神经受到刺激后，M3可能调节胆碱产生血管的舒张反应，其机制是由于激动血管内皮细胞M3亚型，导致内皮依赖性舒张因子即一氧化氮释放，从而引起邻近平滑肌细胞松弛。受体拮抗剂长效性分析方法，具体地说是M3受体拮抗剂长效性分析新方法的专利技术及应用，所述的M3受体的拮抗剂包括噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵和异丙托溴铵。长效抗胆碱药物以选择性阻断M3受体的噻托溴铵为代表，是一种新型、高效、长效的季铵类吸入型抗胆碱药，目前已被广泛应用于慢性阻塞性肺疾病(COPD)的临床治疗中。现有技术评价受体M3拮抗剂的长效性的方法存在以下问题：目前主要通过放射性配体的竞争性结合试验来确认，但此方法存在一定的局限性，如需要洗涤和过滤、试验周期长及筛选通量低等不足等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中存在的问题，借助于新型无标记细胞整合药理学技术，提供一种新的、更方便、更简易且更高效的评价M3受体拮抗剂长效性的方法。本专利技术的技术方案为：1)基于无标记细胞整合药理学技术，利用稳定表达M3的细胞系HEK-293T-M3，借助于已知的激动剂和拮抗剂，评价药物分子的长效性；2)对激动剂和拮抗剂进行拮抗剂的拮抗活性的检测，得到拮抗剂的IC80值或者IC50值；3)利用得到的拮抗剂的IC80值或者IC50值对拮抗剂进行长效性分析；4)根据拮抗剂解离不同时间后的DMR信号谱判断该拮抗剂的长效性。进一步的，所述步骤1)中无标记细胞整合药理学技术为利用共振波导光栅(RWG)生物传感器将药物导致的细胞内成分的动态再分布现象转化为整体的、动态的波长位移响应信号，此信号为波长变化的响应值(pm)，通过Epic光学生物传感器384微孔板实现。进一步的，所述步骤1)中已知的激动剂包括卡巴胆碱，拮抗剂包括噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵、异丙托溴铵。进一步的，所述步骤2)中拮抗剂的拮抗活性的检测步骤具体如下：[1]在细胞兼容的具有光学生物传感功能的384微孔板中接种HEK-293T-M3细胞，接种的细胞密度为1.0～4.5×104个/孔，细胞培养液体积为40μL/孔，接种后细胞培养时间为18～24h；[2]将溶解在HBSS缓冲盐中的卡巴胆碱激动剂以浓度为0.1～10000nM加入到接种HEK-293T-M3细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；[3]将溶解在HBSS缓冲盐中的噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵和异丙托溴铵拮抗剂分别以浓度为0.01～100000nM加入到接种HEK-293T-M3细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；[4]再向已加入了噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵和异丙托溴铵的细胞板中继续加入与具有最高响应强度对应的浓度的卡巴胆碱，分别检测脱敏DMR特征信号谱和拮抗DMR特征信号谱；[5]获得的所有DMR特征信号谱具有浓度-响应依赖关系且具有灵敏性、饱和性及特异性的，并计算每个拮抗剂的IC80值或者IC50值。进一步的，所述拮抗剂的拮抗活性的检测步骤[2]、步骤[3]、步骤[4]中检测DMR特征信号谱使用的检测平台为康宁第三代成像仪，步骤[2]和步骤[3]检测的信号是细胞动态质量重置(DMR)引起的波长位移，步骤[4]检测的信号是药物作用于细胞引起的共振波长的变化值。进一步的，所述步骤3)中拮抗剂的长效性分析步骤如下：[1]在细胞兼容的具有光学生物传感功能的384微孔板中接种HEK-293T-M3细胞，接种的细胞密度为1.0～4.5×104个/孔，细胞培养液体积为40μL/孔，接种后细胞培养时间为18～24h；[2]将溶解在HBSS缓冲盐中的噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵和异丙托溴铵拮抗剂分别以浓度为IC80值或者IC50值加入到接种HEK-293T-M3细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；[3]拮抗剂与受体作用1h后在不同时间段洗净拮抗剂溶液，重新加入40μLHBSS缓冲盐；[4]向[3]加入了新的HBSS缓冲盐的细胞板中继续加入与具有最高响应强度对应的浓度的卡巴胆碱，分别检测拮抗DMR特征信号谱；[5]获得的所有DMR特征信号谱为每个拮抗剂在解离不同时间里剩余的拮抗作用。进一步的，所述步骤4)中判断该拮抗剂的长效性的判断依据是在解离不同时间里每个拮抗剂的拮抗作用。与最接近的现有技术比，本专利技术提供的技术方案具有如下有益效果：1.本专利技术提到的受体拮抗剂长效性分析新方法利用无标记细胞整合药理学技术，与之前通过放射性配体的竞争性结合试验方法相比无需放射性标记，可以有效的缩短试验周期、降低试验难度、提高试验效率，筛选通量高及操作简便等特点。2.本专利技术评价出的结果是噻托溴铵和雷芬那辛均为M3受体长效拮抗剂，格隆溴铵为M3受体中长效拮抗剂，异丙托溴铵为M3受体短效拮抗剂，这一结果与前人报道的结论一致。因此本方法具有检测结果可靠、灵敏度高的优点。附图说明图1A-不同浓度的卡巴胆碱在HEK-293T-M3细胞上的实时DMR响应信号；图1B-不同浓度的卡巴胆碱在HEK-293T-M3细胞上的浓度-响应依赖曲线；其中卡巴胆碱的浓度单位为nM；图2A-噻托溴铵在HEK-293T-M3细胞上的DMR响应信号；图2B-噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵和异丙托溴铵预处理1h后，200nM卡巴胆碱在HEK-293T-M3细胞上的浓度-响应依赖曲线；图3A-噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵和异丙托溴铵预处理1h后，分别于10min、30min、60min、90min和120min洗净微孔板中的拮抗剂溶液，并重新加入40μL的HBSS缓冲盐，并保留1组不洗净拮抗剂溶液，然后分别加入200nM的卡巴胆碱作用1h的时间-响应依赖曲线；图3B-解离2h后每个抑制剂对卡巴胆碱的抑制率。具体实施方式为了能够更加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种受体拮抗剂长效性分析方法，借助于新型无标记细胞整合药理学技术，其受体拮抗剂长效性分析方法包括以下步骤：/n1）基于无标记细胞整合药理学技术，利用稳定表达M3的细胞系HEK-293T-M3，借助于已知的激动剂和拮抗剂，评价药物分子的长效性；/n2）对激动剂和拮抗剂进行拮抗剂的拮抗活性的检测，得到拮抗剂的IC80值或者IC50值；/n3）利用得到的拮抗剂的IC80值或者IC50值对拮抗剂进行长效性分析；/n4）根据拮抗剂解离不同时间后的DMR信号谱判断该拮抗剂的长效性。/n

【技术特征摘要】
1.一种受体拮抗剂长效性分析方法，借助于新型无标记细胞整合药理学技术，其受体拮抗剂长效性分析方法包括以下步骤：
1）基于无标记细胞整合药理学技术，利用稳定表达M3的细胞系HEK-293T-M3，借助于已知的激动剂和拮抗剂，评价药物分子的长效性；
2）对激动剂和拮抗剂进行拮抗剂的拮抗活性的检测，得到拮抗剂的IC80值或者IC50值；
3）利用得到的拮抗剂的IC80值或者IC50值对拮抗剂进行长效性分析；
4）根据拮抗剂解离不同时间后的DMR信号谱判断该拮抗剂的长效性。


2.根据权利要求1所述的方法，所述步骤1）中无标记细胞整合药理学技术为利用共振波导光栅生物传感器将药物导致的细胞内成分的动态再分布现象转化为整体的、动态的波长位移响应信号，此信号为波长变化的响应值，通过Epic光学生物传感器384微孔板实现。


3.根据权利要求1所述的方法，所述步骤1）中已知的激动剂包括卡巴胆碱，拮抗剂包括噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵、异丙托溴铵。


4.根据权利要求1所述的方法，所述步骤2）中拮抗剂的拮抗活性的检测步骤具体如下：
[1]在细胞兼容的具有光学生物传感功能的384微孔板中接种HEK-293T-M3细胞，接种的细胞密度为1.0~4.5×104个/孔，细胞培养液体积为40µL/孔，接种后细胞培养时间为18~24h；
[2]将溶解在HBSS缓冲盐中的卡巴胆碱激动剂以浓度为0.1~10000nM加入到接种HEK-293T-M3细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；
[3]将溶解在HBSS缓冲盐中的噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵和异丙托溴铵拮抗剂分别以浓度为0.01~100000nM加入到接种HEK-293T-M3细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁鑫淼，单彩龙，王纪霞，王志伟，于广璞，薛珍珍，
申请(专利权)人：泰州医药城国科化物生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32