一种大肠杆菌大规模高效表达超螺旋质粒DNA的发酵方法技术

本发明专利技术公开了一种大肠杆菌大规模高效表达超螺旋质粒DNA的发酵方法，通过发酵过程中的温度调控变换改变大肠杆菌的代谢模式，在减少菌体生物量累计的同时，提高超螺旋质粒DNA的表达量，以满足基因治疗中对超螺旋质粒DNA的巨大需求。相比较大肠杆菌发酵超螺旋质粒DNA常规工艺得到的100‑300mg/L产量，采用本发明专利技术发酵方法可得到500‑1000mg/L的产量水平。

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌大规模高效表达超螺旋质粒DNA的发酵方法
本专利技术属于生物工程
，涉及一种生物
中用于基因治疗使用的超螺旋质粒DNA的发酵方法，特别是一种通过温度转换调控来改变菌体代谢模式的高产发酵方法。
技术介绍
基因治疗(genetherapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。其中也包括转基因等方面的技术应用，也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说，基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。基因治疗主要采用病毒和非病毒两种载体形式，用于将目的基因转移至病人的受体细胞中。当前主流的基因治疗模式均是使用病毒载体。目前最为常用的病毒载体包括腺相关病毒(Adeno-associatedvirus,AVV)、慢病毒(Lentivirus,LV)、腺病毒(Adenovirus,AdV)和逆转录病毒(Retrovirus,RV)等。这些病毒载体均可以通过超螺旋质粒DNA进行包装得到，正因如此，质粒DNA是基因治疗的基础，其需求量非常大。超螺旋质粒DNA作为人用生物制品，对其生产与质量控制有着严格的要求。一次性全封闭式生产工艺是基因治疗行业的发展趋势，工艺更加稳定可控，产品质量更加安全有效。当前主流生产超螺旋质粒DNA的方法是通过大肠杆菌发酵得到，使用的培养基则为NTC3018(分批)和NTC3019(补料分批)培养基，其对于分批和补料工艺中的具体成分都是经过优化的。例如其中利用甘油取代作为碳源的葡萄糖，对其中的微量元素和硫酸镁浓度也经过优化。但是基于现有生产超螺旋质粒DNA的工艺方法中的菌种和质粒载体分子量大小等影响，最终产量普遍在50-400mg/L，有少数工艺可以达到500-600mg/L，但是并不能维持稳定的高水平表达，其中很大比例的发酵工艺得到的单位重量菌体的产量为0.5-2mg/g之间。目前现有工艺存在的问题就是发酵产量低的同时，单位重量菌体的产量还是偏低，这样的表达水平对下游的纯化分离会造成相当大的工作量，因为目前超螺旋质粒DNA单位批次的纯化分离还是以重量计。超螺旋质粒DNA低表达水平的发酵收集得到的菌体其中必定有高度表达的宿主DNA、宿主蛋白以及RNA组成，这些都是纯化分离过程中需要去除的杂质，同样会提升分离纯化的压力。所以如何有效提升总产量及单位重量菌体的表达是尤为重要的，如何提高总产量的同时还能减少菌体的复制生产，以减少收货菌体的重量，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的，就是为了解决上述问题而提供了一种大肠杆菌大规模高效表达超螺旋质粒DNA的发酵方法，通过发酵过程中的温度调控变换改变大肠杆菌的代谢模式，在减少菌体生物量累计的同时，提高超螺旋质粒DNA的表达量，以满足基因治疗中对超螺旋质粒DNA的巨大需求。本专利技术的目的是这样实现的：本专利技术的一种大肠杆菌大规模高效表达超螺旋质粒DNA的发酵方法，包括以下步骤：1)摇瓶接种：菌种库中取出保存的工作种子，水浴复苏之后，无菌环境下接种至摇瓶中，30℃培养6-10小时，准备接种发酵罐；2)发酵罐准备：将发酵培养基和补料培养基充分溶解之后，定容到对应体积装入发酵罐和补料瓶中，通过高压蒸汽灭菌进行灭菌处理；3)罐体冷却降温：灭菌结束之后，冷却至室温，连接冷却水和冷凝水管路，连接pH电极、溶氧电极以及温度电极，待罐体保持发酵温度恒定；4)参数设置：设置发酵罐搅拌转速为200-300rpm，通气量为2-3L/min，设置pH为7.0±0.2，开启自动控制补碱和补酸瓶进行调节，设置罐体压力为0.5-0.6bar，设置好起始发酵温度在最大转速和最大通气情况下溶氧电极校准100％点，发酵起始温度为30-35℃；5)接种：在火焰保护下，将摇瓶中的一级种子接入发酵罐罐体中；6)发酵过程调控：接种后，通过增加转速和通气量来维持DO在40％左右，等DO出现骤升反弹之后，即可开始进行补料，补料与DO进行联动，保持DO在40％；7)温度转换：当DO参数稳定在40％±10％之后的0-2小时内，罐体发酵温度转换温度为37-48℃；8)菌体收集：发酵结束后，通过高速离心收集菌体，并置于-20℃冰箱保存菌体。上述的一种大肠杆菌大规模高效表达超螺旋质粒DNA的发酵方法，其中，步骤1)工作种子保存于-80度冰箱中；复苏水浴温度范围为30-42℃；培养至OD600到达0.8-1.1即可安排接种，选用的感受态细胞为E.ColiStbl3。上述的一种大肠杆菌大规模高效表达超螺旋质粒DNA的发酵方法，其中，步骤2)中在发酵罐上安装好pH电极、溶氧电极，连接电极接头，对pH电极和溶氧电极进行校准，pH电极校正点为4.0和7.0，溶氧电极零点通过饱和亚硫酸钠进行校准，高压蒸汽灭菌的条件为121℃，20min。上述的一种大肠杆菌大规模高效表达超螺旋质粒DNA的发酵方法，其中，步骤4)中通过25-28％的氢氧化铵和5-10％的磷酸调节pH。上述的一种大肠杆菌大规模高效表达超螺旋质粒DNA的发酵方法，其中，步骤5)中所述摇瓶一级种子的接种体积为发酵罐体积的5-10％。上述的一种大肠杆菌大规模高效表达超螺旋质粒DNA的发酵方法，其中，步骤6)中增加转速范围为50-100rpm。上述的一种大肠杆菌大规模高效表达超螺旋质粒DNA的发酵方法，其中，步骤7)中补料起始补料速度为0.5mL/min，。上述的一种大肠杆菌大规模高效表达超螺旋质粒DNA的发酵方法，其中，步骤1)中所述摇瓶培养基为LB培养基，成分为蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L。上述的一种大肠杆菌大规模高效表达超螺旋质粒DNA的发酵方法，其中，步骤2)中每1L所述发酵培养基包括：大豆蛋白胨5-10g，酵母粉8-12g，硫酸铵4-8g，磷酸二氢钾3-6g，磷酸氢二钠1-3g，甘油5-15g，消泡剂0.5-1mL，无水硫酸镁0.5-2g，微量元素1-3mL。上述的一种大肠杆菌大规模高效表达超螺旋质粒DNA的发酵方法，其中，步骤2)中每1L所述补料培养基包括：无水硫酸镁5-20g，甘油200-600g，酵母提取物10-40g，大豆蛋白胨40-80g。本专利技术发酵方法，与现有技术相比较，具有以下优点：1、采用甘油取代葡萄糖作为碳源，减少了菌体发酵过程中的产酸现象，降低了生长抑制效应；2、通过前期较低温度培养，降低了菌体生物量的累计，后续通过温度转换，同时转换了菌体的代谢模式，刺激菌体大量表达拷贝超螺旋质粒DNA；3、发酵调控过程DO始终通过多参数联动来维持在40％，参数明确稳定，可重复性高且经多次验证可有效刺激菌体高效表达拷贝；4、补料速度除了工作速度之外，同样依据DO进行联动补料，可有效形成菌体的饥饿发酵模式，保持菌体生物量较低的水平下，得到非常高的超螺旋质粒DNA表达量；5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大肠杆菌大规模高效表达超螺旋质粒DNA的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)摇瓶接种：菌种库中取出保存的工作种子，水浴复苏之后，无菌环境下接种至摇瓶中，30℃培养6-10小时，准备接种发酵罐；/n2)发酵罐准备：将发酵培养基和补料培养基充分溶解之后，定容到对应体积装入发酵罐和补料瓶中，通过高压蒸汽灭菌进行灭菌处理；/n3)罐体冷却降温：灭菌结束之后，冷却至室温，连接冷却水和冷凝水管路，连接pH电极、溶氧电极以及温度电极，待罐体保持发酵温度恒定；/n4)参数设置：设置发酵罐搅拌转速为200-300rpm，通气量为2-3L/min，设置pH为7.0±0.2，开启自动控制补碱和补酸瓶进行调节，设置罐体压力为0.5-0.6bar，设置好起始发酵温度在最大转速和最大通气情况下溶氧电极校准100％点，发酵起始温度为30-35℃；/n5)接种：在火焰保护下，将摇瓶中的一级种子接入发酵罐罐体中；/n6)发酵过程调控：接种后，通过增加转速和通气量来维持DO在40％左右，等DO出现骤升反弹之后，即可开始进行补料，补料与DO进行联动，保持DO在40％；/n7)温度转换：当DO参数稳定在40％±10％之后的0-2小时内，罐体发酵温度转换温度为37-48℃；/n8)菌体收集：发酵结束后，通过高速离心收集菌体，并置于-20℃冰箱保存菌体。/n...

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌大规模高效表达超螺旋质粒DNA的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)摇瓶接种：菌种库中取出保存的工作种子，水浴复苏之后，无菌环境下接种至摇瓶中，30℃培养6-10小时，准备接种发酵罐；
2)发酵罐准备：将发酵培养基和补料培养基充分溶解之后，定容到对应体积装入发酵罐和补料瓶中，通过高压蒸汽灭菌进行灭菌处理；
3)罐体冷却降温：灭菌结束之后，冷却至室温，连接冷却水和冷凝水管路，连接pH电极、溶氧电极以及温度电极，待罐体保持发酵温度恒定；
4)参数设置：设置发酵罐搅拌转速为200-300rpm，通气量为2-3L/min，设置pH为7.0±0.2，开启自动控制补碱和补酸瓶进行调节，设置罐体压力为0.5-0.6bar，设置好起始发酵温度在最大转速和最大通气情况下溶氧电极校准100％点，发酵起始温度为30-35℃；
5)接种：在火焰保护下，将摇瓶中的一级种子接入发酵罐罐体中；
6)发酵过程调控：接种后，通过增加转速和通气量来维持DO在40％左右，等DO出现骤升反弹之后，即可开始进行补料，补料与DO进行联动，保持DO在40％；
7)温度转换：当DO参数稳定在40％±10％之后的0-2小时内，罐体发酵温度转换温度为37-48℃；
8)菌体收集：发酵结束后，通过高速离心收集菌体，并置于-20℃冰箱保存菌体。


2.如权利要求1所述的一种大肠杆菌大规模高效表达超螺旋质粒DNA的发酵方法，其特征在于，步骤1)工作种子保存于-80度冰箱中；复苏水浴温度范围为30-42℃；培养至OD600到达0.8-1.1即可安排接种，选用的感受态细胞为E.ColiStbl3。


3.如权利要求1所述的一种大肠杆菌大规模高效表达超螺旋质粒DNA的发酵方法，其特征在于，步骤2)中在发酵罐上安装好pH电极、溶氧电极，...

【专利技术属性】
技术研发人员：商一骅，
申请(专利权)人：上海汉尼生物细胞技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31