一种黑曲霉生产胞外多聚物的优化培养基及培养方法技术

本发明专利技术属于黑曲霉生产胞外多聚物培养技术领域，公开了一种黑曲霉生产胞外多聚物(ECP)的优化培养基及培养方法，所述黑曲霉生产胞外多聚物的优化培养方法，包括：选择一株高产ECP的黑曲霉为实验材料，制备孢子悬液，并进行菌株发酵培养；提取、纯化、分析不同生长阶段产生ECP的数量、化学成分与结构，探析其与重金属离子的络合作用及机理；通过响应曲面法对生产ECP的培养条件进行优化。在无菌操作台上，用定量无菌水冲洗平板培养基表面菌落，将洗脱孢子转移至灭菌锥形瓶中，加入少量十二烷基硫酸钠摇匀，即得到孢子悬浮液。本发明专利技术为深入了解水环境中重金属的迁移转化过程，进一步为揭示生物膜吸附重金属的机理提供重要参考。示生物膜吸附重金属的机理提供重要参考。示生物膜吸附重金属的机理提供重要参考。

【技术实现步骤摘要】
一种黑曲霉生产胞外多聚物的优化培养基及培养方法


[0001]本专利技术属于黑曲霉生产胞外多聚物培养
，尤其涉及一种黑曲霉生产胞外多聚物的优化培养基及培养方法。

技术介绍

[0002]目前，黑曲霉Aspergillus niger A80为实验室从某地区重金属污染土壤分离得到的一株真菌微生物。该菌株最适生长温度为28～30℃，能够大量分泌胞外多糖，并具有生产周期短、生长条件易控制等优点。真菌胞外多聚物除了含有胞外多糖，还含有蛋白质、脂肪、草酸和黑色素等物质，这些物质在对重金属的表面吸附、络合作用、草酸盐微沉淀、胞外还原等微观作用机制上都具有重要贡献。单因子实验考察不同碳源和氮源对菌体生长状态和ECP产量的影响，优化ECP生产培养基成分，建立ECP生产模型，提高ECP产率。微生物ECP对重金属具有很强的结合能力，但是，由于不同微生物ECP的成分存在差异，导致其与重金属的相互作用机制亦有所不同。一直以来，国内外研究主要集中于细菌ECP方面，而较少涉及真菌ECP的研究。然而，研究证明真菌菌体对重金属也表现出较好的吸附能力，如少根根酶、烟曲霉等。真菌易于培养且可从许多工业副产品或废弃物中获得，可作为良好的生物吸附材料。每年从工业发酵厂和废水处理厂排放出的大量微生物菌体是一种极具潜在应用价值的生物吸附剂，将其用于重金属的吸附治理，在废物利用的同时也可解决重金属污染的治理问题。生物吸附技术在重金属污染废水处理领域已引起普遍关注，但该技术目前还只处于实验阶段。目前国内对生物吸附重金属的研究，主要探讨各因素对吸附过程的影响，对吸附机理的研究较少。因此，针对筛选的黑曲霉真菌，利用其ECP对重金属的良好络合作用，将其用于重金属废水污染治理与修复，通过研究ECP的提取方法、产量影响因素、组成和结构，探讨其对重金属的微观分子作用机制，为该项技术的进一步工程化应用和重金属污染废水的生物修复提供技术和理论支持，取得污水废物资源利用与环境生态修复的双赢效果，具有重要的理论意义和广泛的应用前景。
[0003]胞外多聚物成分结构及影响产量的因素
[0004]化学组成及结构
[0005]ECP是微生物分泌的高分子聚合物，成分复杂，其组成和结构随微生物种类而呈现出不同的特性。根据化学组成的不同，ECP大致可分成以下几类：多糖，如壳聚糖和纤维素杂多糖；聚酰胺，如蛋白质和聚氨基酸；核酸，如脱氧核糖核酸和核糖核酸；聚硫酯；聚酚，如腐殖酸和木质素；聚异戊二烯，如天然橡胶或古塔波胶等。其中，最常见的是多糖类，其次是蛋白类。
[0006]环境影响因素
[0007]影响微生物生长及ECP产量的环境因素包括培养基营养条件和培养物理环境条件。培养基营养条件主要包括：碳源、氮源及其它营养物质。培养物理环境条件包括：体系pH值、温度、培养时间和振荡搅拌速率等因素。
[0008]营养条件
[0009]碳源对微生物ECP的分布及其产量有显著影响。菌株R.erythropolisn在以正十五烷作碳源时，分泌的ECP主要分布于细胞表面；而在以葡萄糖作碳源时，产生的大部分ECP存在于发酵液中。此外，利用菌株R.erythropolisn生产ECP时，以正十五烷作碳源比以葡萄糖作碳源的ECP产量更高。研究发现，对于菌株C.glutamicum CCTCCM 201005而言，在菌体生长过程中，葡萄糖、蔗糖和果糖均能被较好地利用，有利于ECP的合成；而以可溶性淀粉、半乳糖、乙醇和乙酸钠等作单一碳源则不利于其ECP的合成与分泌。氮源同样显著影响微生物的生长繁殖及新陈代谢。有报道指出，黑曲霉在酵母膏、氯化铵、硫酸铵、硝酸钠、牛肉膏、鱼粉、大豆粉、蛋白胨和尿素中均能良好生长，但只有在以硝酸钠和尿素为氮源的培养基中，才能较好地合成ECP。利用菌株R.erythropolis生产ECP的过程中发现，选择硫酸铵和尿素作无机氮源，选择酪蛋白水解物和酵母膏作有机氮源的情况下，菌株均能很好地生长，且能够促进ECP的合成，但在以某些无机氮化合物(如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵)作氮源时，菌株菌丝体几乎无生长现象，亦不能有效合成ECP。Bacillus licheniformis CCRC12826在以氯化铵作氮源的培养基中，ECP产量高达13.9g/L，但在以硝酸铵、蛋白胨和硫酸铵作氮源的培养基中，菌株不能有效合成ECP。
[0010]环境条件，液体发酵体系的pH值是有效微生物生长和ECP合成的主要因素。培养基的pH值升高或降低会影响微生物代谢过程中电子的传递，从而影响菌体ECP的合成与分泌。不同的ECP产生菌具有不同的较适pH值范围。有研究发现，在pH 5～7范围内，黑曲霉菌体能够很好地生长，发酵液粘稠，ECP产量较高；发酵培养基初始pH为6时，ECP产量达到最高。而菌株C.xerosis适合在较低pH值环境条件下合成ECP。假单胞菌Pseudomonas sp.GX4
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1生产ECP的最佳H值范围为pH 7～9，发酵的初始pH过高或过低均不利于菌体的生长及ECP的合成，特别是偏酸性条件下，该菌几乎不能合成ECP。此外，合成ECP的最佳pH值范围与菌株生长的最佳pH值范围间也并非完全一致。Paenibacillus polymyxa GA1菌体生长的最佳pH值为7.0，而合成ECP的最佳初始pH值则为6.5，且偏酸或偏碱环境均不利于菌体生长。
[0011]温度是影响ECP产量的另一个重要因素。ECP产生菌在各自最适温度条件下实现ECP的大量合成。研究发现，多种细菌(Pseudomonassp.GX4
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1，Bacillus sp.DP
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152，Alc.latus和Citrobacter sp.TKF04)可在30℃条件下有效合成ECP。黑曲霉生产的最佳合成ECP温度范围是30～34℃；菌株Zoogloea MP6最佳生产ECP的温度为20℃；对于菌株Enterobacter sp.BY
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29而言，此温度为37℃。
[0012]通气量也是影响ECP产量的因素之一。通气量通过控制装液量或摇床转速实现。装液量大，传质速率慢，溶解氧浓度就低；摇床振荡速率高，溶解氧得到及时补充，发酵液溶解氧浓度就高。用250mL锥形瓶培养Bacillus megarium A25时发现，装液量超过150mL时，发酵液中没有检测到ECP的合成。培养菌株Pseudomonas putidaB6的过程中，摇床振荡速度为80rpm时，发酵液中的菌体聚集成团，影响菌体与培养液的充分接触，不利于其对营养物质的利用，从而影响菌体生长和ECP的合成；然而，过大的通气量也不利于Pseudomonas putidaB6分泌ECP，最适宜的摇床转速为120～160rpm。接种量也会影响ECP的合成。接种量过大，发酵液中菌体初始浓度过高，菌体的生长繁殖导致发酵液营养物质的过度消耗，不利于ECP的合成；接种量过小，发酵液菌体浓度太低，菌株培养周期延长，导致ECP产量降低。
[0013]传统的优化方法是单因子实验法，即每次实验只改变本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种黑曲霉生产胞外多聚物的优化培养基，其特征在于，所述黑曲霉生产胞外多聚物的优化培养基包括：平板培养基—PDA培养基、发酵培养基；平板培养基—PDA培养基：马铃薯200g/L，琼脂15～20g/L，葡萄糖20g/L，pH自然，121℃高压灭菌20min；发酵培养基：NaNO31.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，KCl 0.025g/L，MgSO4·
7H2O 0.025g/L，蔗糖100g/L，酵母膏1.6，pH自然，121℃高压灭菌20min。2.如权利要求1所述黑曲霉生产胞外多聚物的优化培养基，其特征在于，所述平板培养基—PDA培养基中马铃薯去皮洗净，称取200g切成小块，加水煮至马铃薯变软，用八层纱布过滤，滤液加入计算量的琼脂和葡萄糖，混匀后用蒸馏水补充至1000mL，121℃灭菌20min，制成斜面或平板，此培养基用于菌种保藏。3.一种实施如权利要求1～2任意一项所述黑曲霉生产胞外多聚物的优化培养方法，其特征在于，所述黑曲霉生产胞外多聚物的优化培养方法，包括：步骤一，选择一株高产ECP的黑曲霉Aspergillus niger A80为实验材料，制备孢子悬液，并进行菌株发酵培养；步骤二，提取、纯化、分析不同生长阶段产生ECP的数量、化学成分与结构，探析其与重金属离子的络合作用及机理；步骤三，通过响应曲面法对A.nigerA80生产ECP的培养条件进行优化。4.如权利要求3所述的黑曲霉生产胞外多聚物的优化培养方法，其特征在于，所述步骤一中，孢子悬液的制备过程为：在无菌操作台上，用定量无菌水冲洗平板培养基表面的菌落，将洗脱孢子转移至灭菌的锥形瓶中，反复几次，加入0.02％w/v的十二烷基硫酸钠摇匀，即得到高浓度的孢子悬浮液，孢子浓度为107个/mL。5.如权利要求3...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘雪，李林，徐其静，罗增明，赵宇，方迪，
申请(专利权)人：西南林业大学，
类型：发明
国别省市：