一种定量蒿属植物花粉中nsLTP过敏原的方法技术

本发明专利技术公开了一种定量蒿属植物花粉中nsLTP过敏原的方法，使用双单抗夹心酶联免疫吸附实验进行定量，其中结合一抗为A2

【技术实现步骤摘要】
一种定量蒿属植物花粉中nsLTP过敏原的方法


[0001]本专利技术涉及生物技术检测
，特别是涉及一种定量蒿属植物花粉中nsLTP过敏原的方法。

技术介绍

[0002]蒿属植物花粉是造成夏秋季节过敏性疾病的主要致敏原之一，据统计，在我国有11.3％的呼吸道过敏性疾病患者对蒿属花粉过敏，北方地区尤为严重(超过50％)。我国蒿属植物分布广泛，种类繁多，其中黄花蒿(Artemisia annua)、艾蒿(A.argyi)、大籽蒿(A.sieversiana)、茵陈蒿(A.capillaris)、野艾蒿(A.lavandulifolia)最为常见，目前用于体外诊断和免疫治疗的花粉提取物主要来自大籽蒿。
[0003]已经鉴定到的蒿花粉过敏原共7种，按照国际免疫学会联合会(I.U.I.S)下属的过敏原命名专门委员会(Allergen Nomenclature Sub
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committee)(http://www.allergen.org)制定的过敏原命名规则，依次命名为Art v 1
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6(来源于A.vulgaris)以及来源于黄花蒿(A.annua)的Art an 7。其中第一组分(Art v 1)和第三组分(Art v 3)是主要过敏原，Art v 1属于类防御素蛋白，被视为蒿花粉过敏的标志过敏原，超过80％的蒿过敏患者对其敏感。Art v 3属于病程相关蛋白第14家族中的非特异性脂质转移蛋白(nsLTP)，分子量大小为9KDa，主要分布在花粉壁上，在欧洲，约有70％的蒿花粉过敏患者对其敏感，而我国约有25％
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66％的患者对其敏感，这种蛋白作为泛过敏原存在于很多种植物中，能够引起广泛的交叉过敏反应，尤其是与蔷薇科水果之间，诱发呼吸道、胃肠道、口腔等的过敏症状，严重影响患者的生活质量。
[0004]目前用于临床诊断和脱敏治疗的制剂主要是花粉提取物，而这些提取物由于种类和批次不同，其中所包含的过敏原有效成分差异很大，有些重要的过敏原在提取物中含量很低，用于诊疗中常出现漏检或脱敏治疗效果不显著等问题，因此，为了提高临床诊疗效率，对提取物中的主要过敏原进行定量是非常重要的。用于过敏原定量的方法包括酶联免疫吸附法(ELISA)，质谱以及其他的分子生物学手段如PCR等，其中双夹心酶联免疫吸附实验是最常用的过敏原定量方法，尤其在检测微量过敏原方面有很高的应用价值，现在已经开发出很多可以用于单一过敏原组分定量的检测试剂盒，如丹麦ALK公司开发的用于Art v 1定量的单抗和多抗组合的酶联免疫(ELISA)检测试剂，桃果实中的nsLTP过敏原(Pru p 3)检测试剂等。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种用于蒿花粉中Art v 3(nsLTP)类型过敏原定量的方法，该方法具有较高的灵敏性和特异性，能够定量常见蒿属花粉中Art v 3类型过敏原。
[0006]利用双单抗夹心酶联免疫吸附实验对我国主要的蒿属花粉提取物(黄花蒿、艾蒿、茵陈蒿、大籽蒿、野艾蒿、细裂叶莲蒿(A.gmelinii))中的nsLTP过敏原进行定量。
[0007]本专利技术包含以黄花蒿和艾蒿花粉提取物免疫小鼠，生产并筛选蒿花粉Art v 3类
型过敏原的特异性单克隆抗体4种(A11
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B2，A9
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G10，5
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E10，A2
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B8)，对4种单抗的亚型和效价进行检测，然后用这4种单抗进行结合实验，筛选出与各种蒿亲和力较强的单抗(A2
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B8和A9
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G10)，并用这些单抗进行进一步的配对实验，筛选出用于双夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)的最适浓度。4种单抗都来源于杭州艾乐吉生物科技有限公司，其中A11
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B2单抗的货号为MA
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A11B2，A9
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G10单抗的货号为MA
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A9G10，5
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E10单抗的货号为MA
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5E10，A2
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B8单抗的货号为MA
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A2B8。
[0008]本专利技术提供了6种我国常见蒿属花粉中Art v 3类型过敏原的氨基酸序列，每种花粉中各鉴定到两种不同亚型，依据IUIS的过敏原命名规则进行命名。与Art v 1相比，Art v 3在不同蒿属花粉中的序列变异更大。
[0009]本专利技术包含用单克隆抗体(A2
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B8)纯化6种花粉提取物中的Art v 3类型过敏原，通过电泳(SDS
‑
PAGE)和质谱(LC
‑
MS/MS)对纯化产物进行鉴定，以BCA法测定纯化出的过敏原浓度，并将其用作标准品对不同蒿花粉提取物中的Art v 3类型过敏原进行定量。
[0010]本专利技术还包含对各种蒿花粉提取物的浓度进行筛选，选择花粉提取物的OD450值处于最佳拟合区间的稀释浓度，进行Art v 3的定量。
[0011]一种定量蒿属植物花粉中nsLTP过敏原的方法，使用双单抗夹心酶联免疫吸附实验进行定量，其中一抗为A2
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B8单抗，来自杭州艾乐吉生物科技有限公司，货号MA
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A2B8；二抗为A9
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G10单抗，来自杭州艾乐吉生物科技有限公司，货号MA
‑
A9G10。
[0012]优选的，二抗用生物素标记。进一步优选的，使用HRP标记的羊抗鼠IgG结合二抗后再加TMB避光显色后进行吸光值检测。进一步优选的，使用蒿属植物对应的nsLTP过敏原标准品进行检测得到吸光值后绘制标准曲线，将待检测的蒿属植物花粉样品检测得到的吸光值代入标准曲线计算得到相应浓度。进一步优选的，北艾用rArt v 3.0201标准品，黄花蒿或细裂叶莲蒿用nArt an 3标准品，艾蒿或野艾蒿用nArt ar 3标准品，茵陈蒿用nArt ca 3标准品，大籽蒿用nArt si 3标准品。进一步优选的，rArt v 3.0201标准品的最低检测阈值为0.25ng/ml，最佳浓度测定范围为2
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128ng/ml；nArt an 3标准品的最低检测阈值为0.25ng/ml，最佳浓度测定范围为2
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128ng/ml；nArt ar 3标准品的最低检测阈值为2ng/ml，最佳浓度测定范围为4
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128ng/ml；nArt ca 3标准品的最低检测阈值为0.5ng/ml，最佳浓度测定范围为4
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128ng/ml；nArt si 3标准品的最低检测阈值为1ng/ml，最佳浓度测定范围为8
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256ng/ml。
[0013]优选，一抗和二抗的使用浓度均为3μg/ml。
[0014]优选的，蒿属植物为黄花蒿、艾蒿、茵陈蒿、细裂叶莲蒿、大籽蒿、野艾蒿或北艾。
[0015]本专利技术一种定量蒿属植物花粉中nsLTP过敏原的方法具有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种定量蒿属植物花粉中nsLTP过敏原的方法，其特征在于，使用双单抗夹心酶联免疫吸附实验进行定量，其中一抗为A2
‑
B8单抗，来自杭州艾乐吉生物科技有限公司，货号MA
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A2B8；二抗为A9
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G10单抗，来自杭州艾乐吉生物科技有限公司，货号MA
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A9G10。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，二抗用生物素标记。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，使用HRP标记的羊抗鼠IgG结合二抗后再加TMB避光显色后进行吸光值检测。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，使用蒿属植物对应的nsLTP过敏原标准品进行检测得到吸光值后绘制标准曲线，将待检测的蒿属植物花粉样品检测得到的吸光值代入标准曲线计算得到相应浓度。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，北艾用rArt v 3.0201标准品，黄花蒿或细裂叶莲蒿用nArt an 3标准品，艾蒿或野艾蒿用nArt ar 3标准品，茵陈蒿用nArt ca...

【专利技术属性】
技术研发人员：高中山，赵岚，高毕远，付婉艺，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：