栉孔扇贝的实时荧光PCR鉴定方法技术

一种栉孔扇贝的实时荧光PCR鉴定方法，包括以下步骤：1)提取样品DNA；2)设计具有栉孔扇贝特异性的引物和探针；上游引物：TGGCTTGTTCCTTTTGCTCTTTAT；下游引物P2：AATCACCATGTCCGTACAAATGTC；带有荧光染料的探针序列为：TGGTTGAACAATATACCCTCCGCTGTCG；所述的荧光染料5

【技术实现步骤摘要】
栉孔扇贝的实时荧光PCR鉴定方法


[0001]本专利技术属于栉孔扇贝的鉴定方法，具体涉及一种栉孔扇贝的实时荧光PCR鉴定方法。

技术介绍

[0002]栉孔扇贝(Azumapecten farreri)属软体动物门(Mollusea)，瓣鳃纲(Lamellibranchia)，翼形亚纲(Pterimorphia)，珍珠贝目(Pterioida)，扇贝科(Pectinidae)，扇贝属(Pecten)。分布于中国(黄海、渤海、东海)、朝鲜半岛、日本等地；在我国主要分布于北部沿海，尤以山东半岛为多；山东长岛、威海、蓬莱、石岛、文登和辽宁大连、长山岛等地是主产地；大连老虎滩、付家庄、小平岛、金州、长海也有分布。北方的大连和山东等海域形成了一定的养殖规模。栉孔扇贝的个体适中，产量高，肉味鲜美，其闭壳肌含有丰富的营养物质，目前已成为我国主要养殖贝类之一。
[0003]传统鉴定栉孔扇贝的方法主要依靠形态学标准，例如：壳色、足丝孔、放射肋、棘等。这些形态学特征的可塑性强，受环境影响大，具有人为的主观倾向性。通常加工后的栉孔扇贝只留下闭壳肌，失去了形态学特征；栉孔扇贝幼虫浮游期、稚贝期还未形成可辨别的形态特征。因此，在这些情况下传统的形态学鉴定无法准确的鉴定栉孔扇贝。所以，开发一种高效实用的基于分子生物学技术的栉孔扇贝鉴定方法，将为栉孔扇贝的生产育苗、科学研究和市场整顿提供有力依据。
[0004]CN 103602738公开了“一种快速鉴定扇贝品种的多重PCR引物及方法”。多重PCR引物由栉孔扇贝引物、华贵栉孔扇贝引物、海湾扇贝引物和虾夷扇贝引物组成。鉴定方法包括以下步骤：提取扇贝基因组总DNA，进行多重PCR扩增，根据琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小判定待检测扇贝种类。该方法采用普通PCR方法，普通PCR方法反应时间较长，且反应液必须经过琼脂糖凝胶电泳检测后才能得到实验结果。琼脂糖凝胶电泳需要荧光素染色，大多数的荧光色染料都具有毒性。同时，电泳法检测特异性不太高，引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。因此，需要研究一种灵敏的、快速的鉴定栉孔扇贝的实时荧光PCR方法。

技术实现思路

[0005]针对现有的栉孔扇贝形态学鉴定的不足、以及普通PCR方法在检测技术中存在的缺点，本专利技术提供一种灵敏的、快速的栉孔扇贝的实时荧光PCR鉴定方法。
[0006]本专利技术的技术解决方案是：一种栉孔扇贝的实时荧光PCR鉴定方法，其具体步骤如下：1、提取待检样品基因组DNA；2、特异性引物和探针的设计与合成根据栉孔扇贝线粒体COX I基因，设计选取具有栉孔扇贝特异性的引物和探针，所述特异性引物和探针分别为：
上游引物P1：TGGCTTGTTCCTTTTGCTCTTTAT；下游引物P2：AATCACCATGTCCGTACAAATGTC；带有荧光染料的探针序列为：TGGTTGAACAATATACCCTCCGCTGTCG；所述的荧光染料5
’
端为FAM标记、3
’
端TAMRA标记；3、实时荧光PCR以所提取的DNA作为模板，加入所述上游引物P1、下游引物P2、带有荧光染料的探针以及实时荧光PCR反应液进行实时荧光PCR反应，记录样品反应的Ct值；所述实时荧光PCR反应体系为：2
×
Premix Ex Taq 10.0μL；10μmol/L上游引物 0.4μL；10μmol/L下游引物 0.4μL；10μmol/L探针 0.8μL；1～100ng/μL样品DNA 2.0μL；ddH2O 6.4μL；所述实时荧光PCR反应条件为：95℃20s，1个循环；95℃3s、58℃30s，40个循环；所述实时荧光PCR方法设置空白对照、阴性对照、阳性对照，判定标准为：空白对照：以ddH2O为模板，按照所述实时荧光PCR反应体系和所述实时荧光PCR反应条件，进行实时荧光PCR反应，检测Ct值大于或等于40；阴性对照：以非栉孔扇贝物种基因组DNA为模板，按照所述实时荧光PCR反应体系和所述实时荧光PCR反应条件，进行实时荧光PCR反应，检测Ct值大于或等于40；阳性对照：以栉孔扇贝物种基因组DNA为模板，按照所述实时荧光PCR反应体系和所述实时荧光PCR反应条件，进行实时荧光PCR反应，检测Ct值小于或等于30；待测样品栉孔扇贝基因检测Ct值大于等于40，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，判定该样品未检出栉孔扇贝基因；待测样品栉孔扇贝基因检测Ct值小于等于36，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，判定该样品检出栉孔扇贝基因；待测样品栉孔扇贝基因检测Ct值在36～40之间，重做实时荧光PCR扩增，再次扩增后结果Ct值大于40且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品未检出栉孔扇贝基因；再次扩增后结果Ct值仍小于40且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品检出栉孔扇贝基因。
[0007]本专利技术利用分子生物学手段，通过检测物种DNA序列中特异性片段，有效解决形态学鉴定不足，为栉孔扇贝样品的快速鉴定检测提供高效的解决方案。
[0008]本专利技术采用实时荧光PCR方法，实时荧光PCR方法是PCR反应体系中加入荧光报告基团和荧光淬灭基团，随着PCR反应的进行，扩增产物不断积累，导致荧光信号不断积累，从而利用荧光信号的变化实时监测整个PCR进程，相较于普通PCR方法具有操作简便、速度快、通过计算机和分析软件实现PCR扩增、产物检测和定量分析一体化等优点。
[0009]本专利技术设计一种栉孔扇贝的实时荧光PCR鉴定方法，具有良好的灵敏性和特异性。采用实时荧光PCR特异扩增法可以快速检测样本中是否含有栉孔扇贝，发挥了实时荧光PCR检测技术的优点，将为栉孔扇贝的生产育苗、科学研究和市场整顿提供有力依据。
附图说明
[0010]图1是本专利技术实施例检测栉孔扇贝阳性样品的荧光PCR扩增图；其中1为栉孔扇贝闭壳肌，2为栉孔扇贝组织样品。
具体实施方式
[0011]实施例11.所用引物和探针：选择栉孔扇贝mtDNA的COX I基因作为对象，通过Primer Express 3.0软件设计实时荧光PCR特异性扩增引物和探针，本专利技术所用的实时荧光PCR引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0012]实时荧光PCR引物和探针序列为：上游引物P1：TGGCTTCTGCCTTTGTTGTTG；下游引物P2：GCAAAAGGGACAAGCCAAAA；探针：AGATTCCCTCGGGTCAACGCTCTGA，该探针的5
’
端用报告荧光染料FAM标记，3
’
端用淬灭荧光染料TAMRA标记。
[0013]2.栉孔扇贝样品DNA的提取：将栉孔扇贝样品置于研钵中，倒入液氮研磨混匀，取200mg样品的液氮混合物，采用PromegaRSC Tissue DNA Kit提取试剂盒提取样品DNA，将提取的DNA溶解在100μL TE中，置于
‑
20℃冰箱保存、备用。
[0014]3.建立实时荧光PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种栉孔扇贝的实时荧光PCR鉴定方法，其特征是：具体步骤如下：a.提取待检样品基因组DNA；b.特异性引物和探针的设计与合成根据栉孔扇贝线粒体COX I基因，设计选取具有栉孔扇贝特异性的引物和探针，所述特异性引物和探针分别为：上游引物P1：TGGCTTGTTCCTTTTGCTCTTTAT；下游引物P2：AATCACCATGTCCGTACAAATGTC；带有荧光染料的探针序列为：TGGTTGAACAATATACCCTCCGCTGTCG；所述的荧光染料5
’
端为FAM标记、3
’
端TAMRA标记；3、实时荧光PCR以所提取的DNA作为模板，加入所述上游引物P1、下游引物P2、带有荧光染料的探针以及实时荧光PCR反应液进行实时荧光PCR反应，记录样品反应的Ct值。2.根据权利要求1所述的栉孔扇贝的实时荧光PCR鉴定方法，其特征是：所述实时荧光PCR反应体系为：3.根据权利要求1所述的栉孔扇贝的实时荧光PCR鉴定方法，其特征是：所述实时荧光PCR反应条件为：95℃20s，1个循环；95℃3s、58℃30s，40个循环。4.根据权利要求1所述的栉孔扇贝的实时荧光PCR鉴定方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：王庆志，杨滴，李大成，滕炜鸣，李华琳，谢玺，于佐安，刘项峰，张明，孙永新，
申请(专利权)人：辽宁省海洋水产科学研究院，
类型：发明
国别省市：