一种小分子多肽及其抗菌抗病毒应用制造技术

本发明专利技术涉及一种小分子多肽及其抗菌抗病毒应用。本发明专利技术所涉及的小分子多肽具有序列列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列及结构特征；该小分子多肽衍生自序列列表中SEQ ID No.2所示凡纳滨对虾抗脂多糖因子LvALF8；经对本发明专利技术涉及的小分子多肽进行功能活性测试，证实其对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和病毒的生长或增殖均具有很强的抑制作用。长或增殖均具有很强的抑制作用。长或增殖均具有很强的抑制作用。

【技术实现步骤摘要】
diversity of anti
‑
lipopolysaccharide factor isoforms in shrimp and their characters related to antiviral activity.Marine Drugs,2015；13(5):2602
‑
2616.)。
[0006]令人感兴趣的是，不同种类的ALF多肽对不同细菌的抑制活性具有明显的差异，提示我们LPS结合结构域因氨基酸组成的不同，其抗菌抗病毒活性差异显著。因此，发掘更多新的LPS结合结构域类型，对于开发更多的抗微生物多肽并对其开发利用具有重要意义。基于此，我们对发现的凡纳滨对虾LvALF8的LPS结合结构域的功能活性进行了研究，利用化学合成的方法合成了环状多肽，研究了其抗菌和抗病毒生物学活性，发现其与已报道LPS结合结构域来源多肽相比具有差异明显的抗菌谱特征，且表现出更广的抗菌谱和更强的抗菌抗病毒活性，具有重要的应用前景。

技术实现思路

[0007]本专利技术旨在提供一种衍生自凡纳滨对虾抗脂多糖因子LvALF8的小分子多肽，具有明显的抗菌和抗病毒活性。
[0008]本专利技术的技术方案如下：
[0009]利用化学合成的方法获得了小分子多肽，具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，其序列特征为：
[0010]SEQ ID No.1：Ac
‑
c(CSYSTRPYFLRWRLKFKSKVWC)
‑
NH2[0011]所述的小分子多肽序列具有二硫键结构。其结构特征在于：小分子多肽序列氨基端第一个半胱氨酸(C)和羧基端第一个半胱氨酸(C)之间具有二硫键结构；多肽的氨基端C的氨基被乙酰化(Ac
‑
)，羧基端C的羧基被酰胺化(
‑
NH2)。
[0012]所述的小分子多肽，其特征在于：所述的小分子多肽衍生自凡纳滨对虾抗脂多糖因子LvALF8。
[0013]所述的凡纳滨对虾抗脂多糖因子LvALF8，其特征为：具有序列列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，具体序列为：
[0014]MTNLRTPWTHWLTLLLLMATSMMLLSAQEMEDQENYASDIFSNIFNSLVKDGEIELLGHYCSYSTRPYFLRWRLKFKSKVWCPGWTLVYGSASESSSVSNSIQNAIINFIQKAYQEGVITEEDAKPWLQGSH。
[0015]所述的小分子多肽具有明显的抗菌抗病毒活性。具体为：对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及病毒的生长或增殖均具有很强的抑制作用。
[0016]所述的小分子多肽可作为抗菌和/或抗病毒的活性成份，可用于制备抗菌和/或抗病毒的药物或制剂中。
[0017]本专利技术有如下优点
[0018]1、本专利技术确定了一种衍生自凡纳滨对虾抗脂多糖因子LvALF8的抗菌抗病毒小分子多肽及其结构特征。
[0019]2、通过本专利技术可开发有效的对虾细菌类和病毒类疾病的防治药物。
附图说明
[0020]图1小分子多肽的骨架结构图；
[0021]图2小分子多肽的空间结构图；
[0022]图3小分子多肽的HPLC纯度检测图；
amides resulting from the linker decomposition of the Rink amide resin.A new cleavage mixture prevents their formation.Journal of Peptide Science 2006；12:227
‑
232.)。
[0050]用N
‑
甲基毗咯皖酣(NMP)冲洗树脂除去多余保护氨基酸，向反应器(固相合成器)中加入20％哌啶/NMP溶液(体积分数)脱除Fmoc基团，反应20min，排空反应器，用5mL NMP振荡冲洗树脂，重复3次，脱除第一个氨基酸残基的Fmoc保护；裸露出的活性氨基基团与下一个被Fmoc进行氨基保护的氨基酸(5mg)的羧基相连，形成第一个肽键(Cys
‑
Trp)。此段的以上步骤循环进行(不同之处在于：只是每次需采用对应的被Fmoc进行氨基保护的氨基酸)直至多肽序列Ac
‑
CSYSTRPYFLRWRLKFKSKVWC
‑
NH2合成完毕，得约20mg线性多肽。
[0051]2)多肽环化
[0052]20mg线性多肽偶联完最后一个氨基酸后，配置0.1mol/L的I2溶液(I2溶于体积比1:1的甲醇：DMF混合溶液中)，加入10mL至固相合成器中，氮气吹拂反应，约6小时。
[0053]3)多肽纯化和鉴定
[0054]用50mL切肽试剂三氟乙酸：苯甲硫醚：苯酚：乙二硫醇：双蒸水(体积比82.5:5:5:2.5:5)将20mg环化后的多肽从载体树脂上裂解下来，2小时后，加入4℃预冷的乙醚100ml使多肽沉淀，离心收集沉淀物，并用乙醚洗涤3遍，真空抽干，得到的多肽粗品经反向液相色谱纯化，纯化后的多肽冻干后进行HPLC纯度检测(图3)和质谱鉴定(图4)。检测HPLC色谱柱为250*4.6mm,Kromasil
‑
C18
‑
5μm；流动相A：0.1％TFA/乙腈,流动相B：0.1％TFA/H2O；线性洗脱梯度：15％A
‑
100％A；流速为1ml/min，检测波长为220nm；一次进样量为10μl。HPLC和MS检测结果显示，合成小分子多肽的纯度为95.355％，分子量为2894.405，与预测分子量(2894.00)基本一致。
[0055]4)抑菌试验
[0056]小分子多肽用50mmol/L pH7.4的PBS溶解至浓度为640μmol/L的溶液，同时以50mmol/L pH7.4的PBS为阴性对照。采用最低抑菌浓度(MIC)方法检测合成多肽对革兰氏阴性菌包括副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、欧文氏弧菌(Vibrio owensii)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、大肠杆菌(Escherichia coli)和革兰氏阳性菌包括表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、吉氏库特菌(Kurthia gibsonii)的抑菌活性。即：将待测大肠杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和吉氏库特菌分别在37℃，200r/min培养条件下于LB培养基中培养至1
×
108cells/mL，副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、欧文氏弧菌和美人鱼发光杆菌培养温度为28℃，200r/min培养条件下于TSB培养基中培养至1
×
108cells/mL；培养的细菌分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小分子多肽，其特征在于：其氨基酸序列如序列列表中SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列。2.按照权利要求1所述的小分子多肽，其结构特征为：所述的小分子多肽序列具有二硫键结构，小分子多肽的氨基端第一个半胱氨酸(C)和羧基端第一个半胱氨酸(C)之间形成二硫键结构。3.按照权利要求1或2所述的小分子多肽，其序列特征在于：SEQ IDNo.1：Ac
‑
c(CSYSTRPYFLRWRLKFKSKVWC)
‑
NH2。4.按照权利要求1或2所述的小分子多肽，其特征在于：所述的环状的小分子多...

【专利技术属性】
技术研发人员：李富花，孙明哲，李诗豪，于洋，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：