一种在碱性条件下降解高效氯氰菊酯的菌群及其富集方法技术

本发明专利技术公开了一种在碱性条件下降解高效氯氰菊酯的菌群，包括多点采集高效氯氰菊酯成分污染化的不同深度土壤样品；培养与转接：将所述土壤样品加入含有高效氯氰菊酯的最低盐培养基中，于37℃条件下进行培养转接，转接培养之后的菌液即为富集筛选得到的高效氯氰菊酯的菌群；采用pH为8.0的最低盐、LB、牛肉膏蛋白胨固体培养基对所述菌群进行稀释分离和多次反复纯化后，并保藏菌种。本发明专利技术使菌群中微生物多样性提高，促进了多菌株之间的协同降解高效氯氰菊酯作用，同时也提高了菌群的鲁棒性，更适应与处理外界条件和污染物浓度剧烈变化的环境修复。化的环境修复。化的环境修复。

【技术实现步骤摘要】
0.2g/L，K2HPO
4 1.5g/L，KH2PO
4 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，(NH4)2SO
4 0.5g/L，高效氯氰菊酯100mg/L，用NaOH调pH为8.0，蒸馏水补充至1000mL。
[0013]进一步地，所述步骤2中菌群的培养条件包括按照1
‑
5％体积比接种后于37℃，120rpm条件下，避光进行培养。
[0014]一种在碱性条件下降解高效氯氰菊酯的菌群,所述菌群在门水平包括Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria，丰度比依次为70～90：3～25：2～25：50～70：0.0001～3。在属水平包括Achromobacter、Hyphomicrobium、Pseudoxanthomonas、Agathobacter、Bacteroides、Rhodococcus、Shinella、Sphingopyxis、Faecalibacterium、Bordetella、Chelatococcus、Bosea、Roseburia、Sutterella、unidentified_Lachnospiraceae、Paramesorhizobium、Dokdonella、Pseudaminobacter、Pusillimonas，丰度比都介于10～0.0000001之间。
[0015]进一步地，所述菌群还包括菌株丰度比为15～0.0000001的Rhodococcus_rhodochrous、Dokdonella_koreensis、Bacteroides_coprocola、Bacteroides_vulgatus、Pseudaminobacter_defluvii、Bacteroides_plebeius、Paracoccus_alcaliphilus、Bordetella_petrii和Hyphomicrobium_sp_CS1GBMeth3。
[0016]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0017]1.本专利技术提供的富集培养碱性条件下降解高效氯氰菊酯菌群的方法，通过优选最低盐培养基各组分的配比、最适pH范围、培养条件优化等，发现当采用优选的最低盐比例和浓度及pH为8.0时，在适宜的条件下培养的情况下，可以从新疆长期连作棉田土壤样品中，富集培养出能够以高效氯氰菊酯作为唯一C源的降解菌群，操作简易，科学可行且对设备要求低，在较短时间内可以富集培养出高效氯氰菊酯降解菌群。
[0018]2.本专利技术采用添加少量简单C源的方法，即使不溶于最低盐培养基的高效氯氰菊酯形成乳浊液，促使其与微生物细胞接触从而加速降解，又为一些早期需要简单C源才能生长代谢的菌株提供了能源物质。最终使菌群中微生物多样性提高，促进了多菌株之间的协同降解高效氯氰菊酯作用，同时也提高了菌群的鲁棒性，更适应与处理外界条件和污染物浓度剧烈变化的环境修复。
[0019]3.采用本专利技术方法筛选得到的功能菌群能够继续保持各种菌株间的协同作用，菌群组成稳定，对菊酯类农药都有一定降解能力，进入自然界后其降解能力持久稳定。
附图说明
[0020]图1为本专利技术的流程示意图
具体实施方式
[0021]下面根据实施例对本专利技术作进一步说明，本专利技术的方式包括但不仅限于以下实施例。
[0022]如图1所示，实施例1：碱性条件下富集培养高效氯氰菊酯降解菌群
[0023]1)土样采集
[0024]从新疆长期连作棉田中采集土壤样品，土壤样品的pH值在7.8以上。包括棉花连作年限在10
‑
30年以上的土地5块，每块地5点法取样，取样深度在1
‑
40cm，每个点取等重量土
壤。土壤样品用无菌塑料袋包装后4℃运回实验室，一份立即用于富集培养，一份置于
‑
20℃保藏。
[0025]2)培养与传代
[0026]将步骤1)采集的各土壤样品等量混匀后取10g添加于含有高效氯氰菊酯浓度为100mg/L的100mL液体最低盐培养基中，所述最低盐培养基配比为NH4NO
3 1.0g/L，MgSO4·
7H2O 0.2g/L，K2HPO
4 1.5g/L，KH2PO
4 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，(NH4)2SO
4 0.5g/L，NaOH调pH为8.0，蒸馏水补充至1000mL。置于250mL三角瓶口以封口膜封口，封口膜表面具有透气孔，置于37℃、120rmp摇床中避光培养。用分光光度法测定生物量变化，稳定后作为传代接种的时间点，其中高效氯氰菊酯浓度可以从10
‑
100mg/L逐渐递增，在培养15天以内测定生长曲线的变化情况，并最高点作为转接点。到达转接后，每次传代按照体积比3％接种，转接时混匀培养液作为接种菌液，以同样的培养条件进行5次以上传代得到降解菌群。
[0027]3)分离纯化：
[0028]采用稀释平板涂布法分离多次转接后得到的高效氯氰菊酯降解菌群菌液(以下简称富集菌液)。将7管9mL的无菌水排列好，按10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑6、10
‑7依次编号。在无菌操作条件下，吸取1mL富集菌液置于第一管9mL无菌水中并震荡，即为10
‑1浓度的菌液。同样方法依次稀释得到10
‑7浓度的菌液。分别从10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑6、10
‑7的菌液中各吸取100μL菌液于涂布于含有100mg/L高效氯氰菊酯的pH为8.0的最低盐固体培养基的平板上，每个浓度的菌液做3个平板。
[0029]将接种有微生物的平板置于37℃的恒温恒湿培养箱中培养，直至长出菌落。所述最低盐固体培养基的成分最低盐培养基相同，只是添加了2％琼脂。待平板长出菌落后，选取长势较好的菌进一步纯化。
[0030]用接种环以无菌操作挑取一环菌落，接种到新制的灭菌平板上，对所选菌株进行进一步纯化。菌株的纯化依据需要将稀释涂布法和划线分离法结合使用。将接种有微生物的平板置于37℃的恒温恒湿培养箱中培养。采用PCR方法对纯化出的优势菌株进行鉴定，所述PCR方法为先提取优势菌株的DNA，之后采用PCR扩增仪将提取的DNA进行PCR扩增，接着进行DNA的琼脂糖凝胶电泳，最后基因组16SrDNA测序分析确定种属。经鉴定，筛选得到的降解菌群主要包括Achromobacter、Hyphomicrobium、Pseudoxanthomonas、Agathobacter、Bacteroides、Rhodococcus、Shinella、Sphingopyxis、Faecalibacterium、Bordetella、Chelatococcus、Bosea、Roseburia、Sutterella、unidentified_Lachnospirac本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种富集培养筛选降解高效氯氰菊酯菌群的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取样：多点采集高效氯氰菊酯成分污染化的不同深度土壤样品；2)培养与转接：将所述土壤样品加入含有高效氯氰菊酯的最低盐培养基中，于37℃条件pH 8.0下进行培养转接，转接培养之后的菌液即为富集筛选得到的高效氯氰菊酯的菌群；3)采用pH为8.0的最低盐、LB、牛肉膏蛋白胨固体培养基对所述菌群进行稀释分离和多次反复纯化后，并保藏菌种。2.根据权利要求1所述一种富集培养筛选降解高效氯氰菊酯菌群的方法，其特征在于，所述转接培养的时间点为实时监测检测其菌液中生物量的变化以及菌液中高效氯氰菊酯的浓度变化并记录生长曲线，当所述生长曲线趋于平缓及曲线下降前的时候作为转接培养点。3.根据权利要求1所述的一种富集培养筛选降解高效氯氰菊酯菌群的方法，其特征在于，所述最低盐培养基配比包括：NaCl 0.3～1.1g/L，NH4NO
3 0.5～1.0g/L，(NH4)2SO
4 0.2～0.7g/L，K2HPO
4 1.0～1.8g/L，KH2PO
4 0.4～0.6g/L，MgSO4·
7H2O 0.1～0.25g/L，pH7.5
‑
8.2，高效氯氰菊酯20～250mg/L，余量为蒸馏水。4.根据权利要求3所述的一种富集培养筛选降解高效氯氰菊酯菌群的方法，其特征在于，所述培养液最低盐培养基的配比优选为NH4NO
3 1.0g/L，MgSO4·
7H2O 0.2g/L，K2HPO
4 1.5g/L，KH2PO
4 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，(NH4)2SO40.5 g/L，高效氯氰菊酯100mg/L，用NaOH调pH为8.0，蒸馏水补充至1000mL。5.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：张伟，张瑞，朱艳蕾，李艳红，
申请(专利权)人：新疆师范大学，
类型：发明
国别省市：