一种新型冠状病毒COVID-19核酸检测引物组、探针组及检测试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术涉及病毒检测技术领域，尤其是涉及一种新型冠状病毒COVID

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒COVID
‑
19核酸检测引物组、探针组及检测试剂盒和检测方法


[0001]本专利技术涉及病毒检测
，尤其是涉及一种新型冠状病毒COVID
‑
19核酸检测引物组、探针组及检测试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒属于β属冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60
‑
140nm，其基因组序列是具有29903bp的单链RNA，其基因特征与SARSr
‑
CoV和MERSr
‑
CoV有明显区别。目前研究显示与蝙蝠SARS样冠状病毒（bat
‑
SL
‑
CoVZC45）同源性达85%以上。基于目前的流行病学调查，该病的潜伏期1
‑
14天，多为3
‑
7天，以发热、乏力、干咳为主要表现，少数患者伴有鼻塞、咽痛和腹泻等症状。重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者快速发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍等。
[0003]新型冠状病毒（COVID
‑
19）作为急性呼吸道传染病已纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，按甲类传染病管理。全球新型冠状病毒感染肺炎疫情形势严峻，确诊和疑似病例数仍在上升，临床诊治压力巨大，且新型冠状病毒可能在较长时间持续存在。为此，发展新型冠状病毒高灵敏性检测体系有利于做好新型冠状病毒防控工作，切实维护人民群众身体健康和生命安全，促进经济社会大局稳定。
[0004]从2020年年初，陆续也有新型冠状病毒（COVID
‑
19）的检测引物组报导，例如，公开号为CN111057797A、2020年1月19日申请的、于2020年4月24日公开的新型冠状病毒2019
‑
nCoV实时荧光定量PCR检测引物和探针、试剂盒和方法；又例如公开号为CN111118228A、申请日为2020年3月31日，于2020年5月8日公开的一种用于新型冠状病毒COVID
‑
19核酸检测试剂盒及其使用方法等，但是从临床使用情况来看，精确度不够，容易出现假阳性、假阴性。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于至少解决现有技术中检测精确度仍有待提升、容易出现假阳性、假阴性的问题。
[0006]为此，本专利技术的第一目的：提出一种新型冠状病毒COVID
‑
19核酸检测引物组，包括核苷酸序列如下的两对特异性引物对：针对病毒ORF1ab基因片段的特异性引物对：ORF1ab
‑
F：如SEQ ID NO: 1所示，5
′‑
TTTAGTTCCCTTCCATCATATGCA
‑3′
，ORF1ab
‑
R：如SEQ ID NO: 2所示，5
′‑
ATTCAGATTTAGCCACATTCAAAGA
‑3′
；针对病毒N基因片段的特异性引物对：N
‑
F：如SEQ ID NO: 3所示，
5
′‑
ATTGCACAATTTGCCCCCAG
‑3′
，N
‑
R：如SEQ ID NO: 4所示，5
′‑
CATCCAATTTGATGGCACCTG
‑3′
。
[0007]本专利技术提供的新型冠状病毒COVID
‑
19检测引物组至少具有如下有益效果：两对特异性引物对分别针对新型冠状病毒的ORF1ab基因和N基因的高度保守区，通过ORF1ab和N基因片段的检测可辅助诊断新型冠状病毒的感染。同时，通过对引物序列的优化，可以提高新型冠状病毒检测的灵敏度，避免假阳性、假阴性情况的发生，且根据标准曲线，能够将低至15copies/mL浓度的阳性样本检测出。
[0008]本专利技术的第二目的是提供了一种与上述新型冠状病毒COVID
‑
1的检测引物组相配合使用的探针组，包括以下探针：针对病毒ORF1ab基因片段的探针：ORF1ab
‑
P：如SEQ ID NO: 5所示，5
′‑
TTTTGCTACTGCTCAAGAAGCTTATGAGC
‑3′
；针对病毒N基因片段的探针：N
‑
P：如SEQ ID NO: 6所示，5
′‑
TTCTTCGGAATGTCGCGCATTG
‑3′
；作为优选，上述探针的5
′
端均标记有荧光报告基团，3
′
端均标记有荧光淬灭基团。
[0009]在PCR扩增过程中，当探针完整时，由于荧光淬灭基团靠近荧光报告基团，荧光报告基因发出的荧光被淬灭基团吸收，不发出荧光信号。而在引物延伸时，与模板结合的探针被 Taq酶（5'
→
3'外切核酸酶活性）切断，荧光报告基团与荧光淬灭基团分离，产生荧光信号，荧光定量PCR仪根据检测到的荧光信号自动绘制出实时扩增曲线，从而实现对新型冠状病毒在核酸水平上的检测。检测结果可选择定性或定量，直接判断是否存在相应的扩增曲线可实现定性检测。根据不同浓度梯度标准品的Ct值绘制相应的标准曲线，以样本的Ct值进行计算可以获得定量结果。另外，基于本领域的一般理解，不同探针的荧光报告基团应不同，以使单管反应时不同基因片段的扩增产生不同波段的荧光信号方便检测。
[0010]进一步优选，ORF1ab
‑
P的5
′
端标记有荧光报告基团FAM，3
′
端标记有荧光淬灭基团BHQ1；N
‑
P的5
′
端标记有荧光报告基团HEX，3
′
端标记有荧光淬灭基团BHQ1。
[0011]本专利技术的第三目的是提供一种新型冠状病毒COVID
‑
19的检测试剂盒，该试剂盒包括上述引物组和上述探针组。
[0012]作为优选，检测试剂盒还包括内标引物对和内标探针；其中，内标引物对的核苷酸序列如下：RNP
‑
F：如SEQ ID NO: 7所示，5
′‑ꢀ
AGATTTGGACCTGCGAGCG
‑3′
，RNP
‑
R：如SEQ ID NO: 8所示，5
′‑
GAGCGGCTGTCTCCACAAGT
‑3′
；内标探针的核苷酸序列如下：RNP
‑
P：如SEQ ID NO: 9所示，5
′‑
TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG
‑3′
。
[0013]试剂盒所用内标为人核糖核苷酸酶P(RNase P,RNP)，通过内标判断是否取到了合
格的患者组织或分泌物标本，对待测样本的采集、运输和提取的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒COVID
‑
19的检测引物组，其特征在于，包括核苷酸序列如下的两对特异性引物对：针对病毒ORF1ab基因片段的特异性引物对：ORF1ab
‑
F：如SEQ ID NO: 1所示，ORF1ab
‑
R：如SEQ ID NO: 2所示；针对病毒N基因片段的特异性引物对：N
‑
F：如SEQ ID NO: 3所示，N
‑
R：如SEQ ID NO: 4所示。2.一种新型冠状病毒COVID
‑
19的探针组，其特征在于，所述探针组包括核苷酸序列如下的两条探针：针对病毒ORF1ab基因片段的探针：ORF1ab
‑
P：如SEQ ID NO: 5所示；针对病毒N基因片段的探针：N
‑
P：如SEQ ID NO: 6所示。3.根据权利要求2所述的探针组，其特征在于，所述探针的5
′
端标记有荧光报告基团，3
′
端标记有荧光淬灭基团。4.根据权利要求3所述的探针组，其特征在于，ORF1ab
‑
P基因片段的探针的5
′
端标记有荧光报告基团FAM，3
′
端标记有荧光淬灭基团BHQ1；N
‑
P基因片段的探针的5
′
端标记有荧光报告基...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏云海，董海燕，杨海兵，邵婕，金玫华，徐德顺，纪蕾，
申请(专利权)人：湖州市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：